Por Palmer Owyoung
Actualizado el 30 de agosto de 2022

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El código genético de una célula reside en su ADN, que permanece encerrado en el núcleo. Para estudiar la expresión génica o generar bibliotecas de ADN complementario (ADNc), el ADN primero debe transcribirse a ARN mensajero (ARNm). Aislar ARNm de alta calidad es esencial para detectar transcripciones raras, diseñar sondas de microarrays y construir bibliotecas de ADNc.

Aislamiento de ARNm a partir de ARN total

Paso 1:Homogeneización de TRIzol

Comience resuspendiendo las células sedimentadas en TRIzol Reagent (Life Technologies) o una solución equivalente de fenol-guanidina, como el TRI Reagent de Ambion. Este reactivo lisa simultáneamente células, desnaturaliza proteínas y protege el ARN de la degradación enzimática.

Paso 2:Aislamiento total de ARN

Realizar una serie de centrifugaciones para separar los componentes celulares en distintas fases. Deseche la capa superior amarilla y rica en grasa. Recoja la fase acuosa roja, que contiene la población completa de ARN (ARNm, ARNt, ARNr y ARN no codificantes). Siga el protocolo de extracción con fenol-cloroformo y luego lave el sedimento de ARN con isopropanol y etanol. Agregue inhibidores de RNasa en todas partes para preservar la integridad del ARN.

Paso 3:extracción de ARNm

Los kits comerciales proporcionan la purificación de ARNm más reproducible. Las opciones populares incluyen FastTrack 2.0 de Invitrogen y el kit de aislamiento de ARNm Poly(A)Pure de Ambion. Un protocolo típico de kit procede de la siguiente manera:

• Combine hasta 300 µl de ARN total con el tampón de lisis inhibido por ARNasa del kit.
• Calentar a 65 °C durante 5 minutos y luego enfriar en hielo.
• Agregue NaCl 0,5 M y disuelva el oligo‑dT (ácido oligodesoxitimidílico) suministrado en la mezcla.
• Centrifugar y recuperar el sobrenadante; une el ARNm a la matriz de sílice proporcionada.
• Lavar repetidamente con tampón de unión bajo en sal y luego con tampón de lavado.
• Eluir el ARNm en el volumen especificado (normalmente ~500 µl).
• Precipite el eluido con acetato de sodio y etanol y luego resuspándalo en 10 a 20 µl de agua tratada con DEPC.
• Almacenar a –80 °C y evaluar la concentración y la pureza utilizando un espectrofotómetro UV.

Cosas necesarias

• Gabinete de flujo laminar
• Equipo de protección personal (bata de laboratorio, guantes, protección para los ojos)
• Pipetas, puntas, recipientes para eliminación de riesgos biológicos
• Centrífuga de alta velocidad, bloque térmico
• Superficies de banco sin ARN
• Reactivos RNAzap o RNAoff
• Kits comerciales de extracción de ARNm (Invitrogen, Ambion, etc.)
• Acetato de sodio, etanol, isopropanol
• Agua tratada con DEPC
• Espectrofotómetro UV y consumibles
• Células aptas para la extracción de ARN
• TRIzol o reactivo TRI
• Inhibidores de la ARNasa

TL;DR

Mantenga fríos todos los reactivos, células y ARN extraído colocándolos en hielo. Las condiciones de frío inhiben la actividad de la RNasa liberada durante la homogeneización.

Advertencia

TRIzol y reactivos similares de fenol-guanidina son tóxicos. Evite el contacto con la piel y las membranas mucosas y cumpla estrictamente con los protocolos de seguridad institucionales.

Referencias

• “Protocolos de biblioteca de ADNc”; Ian G. Cowell y Caroline A. Austin, 1997
• “Protocolos de traducción y transcripción in vitro”; Martín J. Tymms, 1995