Por Sara Quinlan
Actualizado el 30 de agosto de 2022
Según BioWeb de la Universidad de Wisconsin, un cebador de PCR es un oligonucleótido sintético corto, normalmente de 18 a 25 nucleótidos de largo, que se utiliza para amplificar segmentos de ADN específicos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Tanto los cebadores directos como los inversos, diseñados como complementos inversos, flanquean la región objetivo para facilitar la amplificación. Cuando los investigadores se dirigen a un gen o región de ADN específico, la PCR genera material suficiente para análisis posteriores. Si no hay cebadores adecuados disponibles en la literatura publicada o en fuentes comerciales, diseñar cebadores personalizados se vuelve esencial.
Comience recuperando la secuencia de nucleótidos de su gen o región de ADN objetivo y decida la longitud del fragmento que desea amplificar. La PCR convencional amplifica fragmentos de entre 100 y 1000 pares de bases, mientras que la PCR en tiempo real normalmente se dirige a fragmentos de 50 a 200 pares de bases.
Determine en qué parte de la secuencia se unirán sus cebadores:cerca del extremo 5′ o 3′, en el medio o abarcando un intrón si lo desea.
Cumplir con las pautas establecidas de diseño de cebadores; el éxito de la amplificación depende de la calidad del cebador y de los parámetros clave.
Diseñe cebadores de 18 a 24 nucleótidos de largo. El Dr. Vincent R. Prezioso, Ph.D., de Brinkmann Instruments recomienda esta gama para una especificidad óptima y un recocido eficiente. Apunte a una temperatura de fusión (Tm) de 55 a 80 °C, un contenido de GC de 40 a 60 % y una abrazadera de GC en el extremo 3'. Evite tres o más bases G/C en las últimas cinco posiciones para reducir la unión no específica.
Evite series de cuatro o más nucleótidos o repeticiones de dinucleótidos idénticos, ya que pueden provocar un cebado incorrecto. Asegúrese de que no haya complementariedad intracebador o entre cebadores que pueda formar autodímeros o dímeros de cebador.
Utilice herramientas en línea acreditadas:Primer3 del MIT. , Primer‑Blast del NCBI y OligoAnalyzer de IDT. —para evaluar las propiedades de los cebadores y predecir estructuras secundarias.
