1. Aislar el ARNm para la proteína objetivo:
* Extracción de ARN: El científico deberá obtener el tejido hepático de las ranas y extraer el ARN total. Esto implica interrumpir las células y usar reactivos especializados para separar el ARN de otros componentes celulares.
2. Crea una biblioteca de ADNc:
* Transcripción inversa: Usando el ARNm aislado, el científico realizará una transcripción inversa. Este es un proceso en el que una enzima llamada transcriptasa inversa convierte el ARNm en ADN complementario (ADNc). Este ADNc servirá como plantilla para la clonación.
* Construcción de la biblioteca de ADNc: El ADNc se inserta en vectores (generalmente plásmidos) que pueden replicarse dentro de las bacterias. Esta colección de vectores que contienen diferentes fragmentos de ADNc se denomina biblioteca de ADNc.
3. Screate la biblioteca para el ADNc de destino:
* Diseño de sonda: El científico necesita una sonda para identificar el ADNc que codifica la proteína de rana deseada. Esta sonda puede ser:
* sonda oligonucleótida: Una secuencia de ADN sintética corta diseñada basada en la secuencia conocida de la proteína objetivo (si está disponible).
* sonda de anticuerpos: Se puede usar un anticuerpo específico de la proteína objetivo para detectar el ADNc correspondiente en la biblioteca.
* Proyección: La biblioteca de ADNc se selecciona con la sonda. Esto se puede hacer utilizando técnicas como:
* Hibridación de colonias: Las bacterias que contienen la biblioteca de ADNc se plantean en agar. La sonda está etiquetada y se le permite unirse a las colonias. Las colonias que contienen el ADNc objetivo se hibriden con la sonda y se pueden identificar.
* PCR Senado: La PCR (reacción en cadena de la polimerasa) se puede usar para amplificar el ADNc objetivo utilizando cebadores diseñados a partir de la secuencia conocida.
4. Secuencia y verificar el ADNc de destino:
* secuenciación de sanger: Una vez que se aísla el ADNc objetivo, debe secuenciarse para confirmar su identidad y garantizar que codifique la proteína correcta.
* Análisis bioinformático: La secuencia de ADNc se puede comparar con las bases de datos para encontrar secuencias homólogas y confirmar su identidad.
5. Diseñe y construya un vector de expresión:
* Vector de expresión: El científico necesitará un vector que pueda usarse para expresar la proteína objetivo en un organismo del huésped adecuado (por ejemplo, bacterias, levadura o células de mamíferos). Este vector de expresión incluirá:
* Promotor: Una secuencia de ADN que impulsa la expresión del gen objetivo.
* Gene objetivo (ADNc): El ADNc aislado que codifica la proteína de la rana.
* Sitio de enlace de ribosoma (RBS): Una secuencia que ayuda a los ribosomas inicia la síntesis de proteínas.
* Marcador de selección: Un gen que permite la selección de células que han tomado el vector de expresión.
6. Transforme el vector de expresión en un organismo del huésped:
* Transformación: El vector de expresión que contiene el ADNc objetivo se introduce en un organismo del huésped (por ejemplo, células bacterianas).
* Selección: Las células transformadas se seleccionan usando el marcador de selección en el vector de expresión.
7. Exprese y purifique la proteína objetivo:
* Expresión de proteína: Las células huésped se cultivan en condiciones que promueven la expresión de la proteína objetivo.
* Purificación de proteínas: La proteína se extrae de las células y se purifica utilizando técnicas como la cromatografía para separarla de otros componentes celulares.
8. Caracterización y análisis:
* Verificación: La proteína purificada se analiza para confirmar su identidad, plegamiento y actividad.
* Estudios funcionales: La proteína puede usarse para futuras investigaciones, como investigar su función, interacciones con otras moléculas o sus posibles usos terapéuticos.
Consideraciones importantes:
* plegamiento de proteínas: Asegurar que la proteína se pliegue correctamente en el organismo del huésped es crucial.
* Modificaciones postraduccionales: Algunas proteínas requieren modificaciones (por ejemplo, glicosilación) después de la traducción. Es posible que el organismo del huésped no pueda realizar estas modificaciones, lo que podría afectar la función de la proteína.
* Ética y seguridad: Se deben seguir consideraciones éticas y protocolos de seguridad adecuados cuando se trabaja con tejidos de rana y organismos genéticamente modificados.
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