1. Extracción y preparación de proteínas:
- El primer paso es extraer proteínas de la muestra de interés. Esto se puede hacer mediante varios métodos, como la lisis celular o la homogeneización de tejidos, seguida de centrifugación para eliminar los restos celulares.
- Luego, las proteínas extraídas se cuantifican, normalmente mediante un ensayo de Bradford o métodos similares, para garantizar una carga de proteínas igual en los pasos posteriores.
2. Separación de proteínas:
- La muestra de proteína se mezcla con un tampón de carga que contiene un agente reductor (p. ej., beta-mercaptoetanol o DTT) y un colorante de seguimiento (p. ej., azul de bromofenol).
- La mezcla de proteínas se carga en un gel de poliacrilamida para electroforesis. El gel se somete a una corriente eléctrica, lo que hace que las proteínas se separen según su tamaño. Las proteínas más pequeñas migran más rápido a través del gel, mientras que las proteínas más grandes se mueven más lentamente.
3. Transferencia de proteínas:
- Después de la electroforesis, las proteínas separadas se transfieren del gel a una membrana de nitrocelulosa o de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Este proceso, conocido como transferencia de proteínas o electrotransferencia, implica colocar el gel y la membrana en un tampón de transferencia y aplicar una corriente eléctrica.
- Como resultado, las proteínas se transfieren del gel a la membrana, creando una réplica de las proteínas separadas.
4. Bloqueo de membrana:
- Para reducir la unión no específica de los anticuerpos, la membrana de nitrocelulosa o PVDF se bloquea con una solución que contiene una proteína como la albúmina sérica bovina (BSA) o leche en polvo desnatada.
- Este paso de bloqueo ayuda a minimizar las señales de fondo y mejora la especificidad de la unión del anticuerpo durante los pasos posteriores.
5. Incubación de anticuerpos primarios:
- La membrana se incuba con un anticuerpo primario que reconoce y se une específicamente a la proteína de interés. Los anticuerpos primarios normalmente se generan contra la proteína diana o un epítopo específico dentro de la proteína.
- Estos anticuerpos se diluyen en un tampón adecuado y se incuban con la membrana, lo que les permite unirse a sus proteínas diana.
6. Lavado:
- Después de la incubación del anticuerpo primario, la membrana se lava minuciosamente para eliminar los anticuerpos no unidos y reducir las señales de fondo. Este paso de lavado es crucial para garantizar la detección específica de la proteína objetivo.
7. Incubación de anticuerpos secundarios (conjugados con una enzima informadora):
- Se utiliza un anticuerpo secundario, conjugado con una enzima como la peroxidasa de rábano picante (HRP) o la fosfatasa alcalina (ALP), para detectar los complejos primarios de anticuerpo-antígeno en la membrana.
- Los anticuerpos secundarios son específicos de cada especie, lo que significa que reconocen y se unen a los anticuerpos primarios producidos en una especie particular (por ejemplo, ratón o conejo).
- El anticuerpo secundario conjugado con enzima se une al anticuerpo primario, creando un complejo que permite la amplificación y visualización de la señal.
8. Lavado:
- Se realiza otro paso de lavado para eliminar los anticuerpos secundarios no unidos y reducir las señales de fondo.
9. Detección quimioluminiscente:
- Para los anticuerpos secundarios conjugados con HRP, se añade un sustrato quimioluminiscente a la membrana. Cuando el sustrato reacciona con HRP, emite luz.
- Se utilizan sistemas especializados de detección por quimioluminiscencia o películas de rayos X para capturar y visualizar las señales luminosas emitidas. La intensidad de la luz corresponde a la cantidad de proteína diana presente en la muestra.
10. Análisis e interpretación de datos:
- La película de rayos X revelada o las imágenes de quimioluminiscencia digitales se analizan para identificar bandas o manchas correspondientes a la proteína objetivo.
- El tamaño y la intensidad de estas bandas pueden proporcionar información sobre el peso molecular, la abundancia y las modificaciones postraduccionales de la proteína detectada.
Siguiendo estos pasos, la transferencia Western permite la detección y el análisis específicos de una proteína de interés en una mezcla compleja de proteínas. Se utiliza ampliamente en diversos campos de la investigación biológica, incluida la biología molecular, la inmunología y el diagnóstico clínico.
