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Las membranas celulares están compuestas de bicapas de fosfolípidos con proteínas incrustadas que median funciones celulares esenciales. La microscopía óptica tradicional no puede resolver proteínas de membrana individuales. La fractura por congelación, combinada con la microscopía electrónica, nos permite dividir las membranas congeladas a lo largo de su bicapa, exponiendo la distribución de proteínas dentro de la matriz lipídica. Al integrar técnicas de etiquetado adicionales, los investigadores pueden mapear proteínas específicas, así como componentes bacterianos y virales, con una precisión subnanométrica.
1. Congele rápidamente células o tejidos en nitrógeno líquido para inmovilizar estructuras.
2. Utilice un microtomo para fracturar la muestra congelada; la membrana se escinde entre las dos valvas de fosfolípidos donde las interacciones hidrofóbicas son más débiles.
3. Realice un grabado por congelación en alto vacío para eliminar los cristales de hielo y preservar los detalles finos.
4. Sombree la cara de la fractura con una fina película de carbono y platino para crear una réplica estable que siga la topología de la membrana.
5. Digiere el material orgánico residual con ácido, dejando una capa de platino que representa la superficie de la membrana expuesta.
6. Examine la réplica mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) para realizar análisis estructurales.
El grabado por congelación elimina los cristales de hielo que, de otro modo, oscurecerían los detalles de la membrana. El proceso de secado al vacío preserva la arquitectura nativa y permite la observación de las actividades dinámicas de la membrana, los orgánulos intracelulares y los ensamblajes virales.
La microscopía electrónica de transmisión ofrece un aumento de hasta 1 millón de veces y resoluciones de hasta 3 nm, lo que la convierte en la modalidad preferida para réplicas de fracturas congeladas. La microscopía electrónica de barrido (SEM) se utiliza con menos frecuencia en este contexto, pero puede proporcionar una topología de superficie de muestras más grandes.
Desde su introducción hace más de cinco décadas, la TEM de fractura por congelación ha sido fundamental para confirmar el modelo de bicapa lipídica de la membrana plasmática y dilucidar la disposición espacial de las proteínas integrales, periféricas y ancladas a lípidos. La técnica revela si las proteínas son "flotadores" que se desplazan dentro de la bicapa o "anclas" que abarcan ambas valvas, y puede detectar agregación o agrupamiento de proteínas. Cuando se combina con el etiquetado con inmunooro (anticuerpos etiquetados con partículas densas en electrones), los investigadores pueden identificar proteínas específicas e inferir sus funciones funcionales.
