Ilustración del método "homo-FRET" de la Universidad de Rice para observar reacciones de fosforilación en tiempo real en sistemas sensoriales de dos componentes en bacterias vivas. Los estímulos específicos fuera de la célula (arriba) inician la fosforilación (centro), que activan las proteínas reguladoras de respuesta que forman pares (abajo a la derecha) para producir una cascada bioquímica que finalmente cambia el comportamiento de la célula. Para observar la fosforilación en tiempo real, los investigadores de Rice diseñaron cepas de E. coli para producir etiquetas fluorescentes verdes que despolarizan la luz de un láser de excitación solo cuando interactúan como pares (extremo inferior derecho). Crédito:Ryan Butcher/Universidad Rice
Los biólogos sintéticos de la Universidad de Rice han desarrollado la primera tecnología para observar la actividad en tiempo real de algunos de los circuitos de procesamiento de señales más comunes en las bacterias, incluidos los patógenos mortales que utilizan los circuitos para aumentar su virulencia y desarrollar resistencia a los antibióticos.
Los sistemas de dos componentes son circuitos sensoriales que las bacterias utilizan para reaccionar ante su entorno y sobrevivir. Las bacterias usan los circuitos, que también se conocen como vías de transducción de señales, para detectar una "gama inigualable de estímulos", desde iones de luz y metal hasta pH e incluso mensajes de sus amigos y vecinos, dijo el profesor de bioingeniería de Rice, Jeffrey Tabor.
La nueva herramienta óptica de Tabor y del investigador postdoctoral Ryan Butcher para observar reacciones de fosforilación en tiempo real en sistemas de dos componentes se describe en un estudio publicado esta semana en Proceedings of the National Academy of Sciences .
"Las bacterias usan sistemas de dos componentes para activar la virulencia y la resistencia a los antibióticos, colonizar huéspedes humanos y vegetales, formar biopelículas y ensuciar dispositivos médicos", dijo Tabor, profesor de bioingeniería y biociencias.
El laboratorio de Tabor ha estudiado durante años los sistemas de dos componentes. En 2019, su equipo presentó un conjunto de herramientas de biohacking que los biólogos sintéticos podrían usar para mezclar y combinar decenas de miles de entradas sensoriales y salidas genéticas de los circuitos.
Uno de los usos más importantes de ese conjunto de herramientas fue desbloquear el doble misterio de los sistemas de dos componentes. Como su nombre lo indica, los circuitos tienen dos funciones:detectar un estímulo fuera de la célula y cambiar el comportamiento de la célula en respuesta a ese estímulo.
El primer componente, conocido como sensor quinasa, generalmente sobresale a través de la pared exterior de la célula y solo puede activarse mediante una señal química específica. Una vez activado, desencadena una cascada bioquímica, una reacción en cadena dentro de la célula que termina cuando la célula cambia su comportamiento en respuesta a los estímulos.
El primer paso en la cascada es un proceso llamado fosforilación, que finalmente resulta en la activación del segundo componente del sistema, el regulador de respuesta.
Aunque las reacciones de fosforilación son clave en las decenas de miles de sistemas de dos componentes empleados en bacterias, ha sido muy difícil observarlas directamente en bacterias vivas. Esto se debe en parte a que los reguladores de respuesta generalmente deben unirse para formar pares para llevar a cabo la cascada biológica que conduce a la respuesta al estímulo.
"El análisis experimental de la fosforilación a menudo requiere la purificación de las proteínas de las bacterias y el análisis mediante laboriosos métodos in vitro como la electroforesis en gel", dijo Butcher.
Butcher creó un método mucho más simple que utiliza etiquetas de proteínas fluorescentes y luz fluorescente polarizada. Diseñó cepas de E. coli para producir sondas de proteína fluorescente mNeonGreen que despolarizan la luz de un láser de excitación, pero solo si interactúan como pares. En una variedad de pruebas, Butcher y Tabor demostraron que su método podría usarse para monitorear la magnitud y la velocidad de la activación del regulador de respuesta bajo una variedad de condiciones ambientales.
El método se denomina "transferencia de energía de resonancia de fluorescencia homotípica" u homo-FRET para abreviar. Tabor dijo que los investigadores pueden usarlo para seguir la activación de sistemas de dos componentes con una resolución de tiempo mucho más alta de lo que era posible anteriormente.
En el estudio, él y Butcher demostraron la utilidad de homo-FRET al observar un sistema de dos componentes activado por nitrato que se sabe que juega un papel en la colonización gastrointestinal por E. coli, Salmonella y otros patógenos.
"Los microbiólogos saben desde hace algún tiempo que este circuito genético es utilizado por una serie de patógenos, pero aún no entendemos completamente cómo funciona", dijo Tabor.
Usando su método, Tabor y Butcher descubrieron un pulso de actividad no reportado previamente en el circuito en respuesta a la adición de nitrato. El pulso parece surgir debido a la rápida activación del sistema de dos componentes seguido del consumo de nitrato por parte de las bacterias y la correspondiente desactivación.
"Esa es una ventana a cómo funciona este circuito, y es el tipo de cosa que habría sido mucho más difícil de precisar con los métodos anteriores", dijo Tabor. "Con homo-FRET podemos ver cómo el circuito responde a los cambios en los niveles de nitrato a medida que sucede".
"Creemos que homo-FRET se puede usar para diseñar biosensores que respondan 10 veces más rápido que las alternativas actuales, y que nosotros y otros podremos usarlo para hacer nuevos descubrimientos en una variedad de otras vías bacterianas", dijo. Biólogos sintéticos piratean sensores bacterianos
