Por Tricia Lobo, actualizado el 30 de agosto de 2022
Las enzimas aceleran las reacciones químicas al reducir la energía de activación. La mayoría de las enzimas funcionan mejor entre 35°C y 40°C, un rango en el que el aumento de la energía cinética mejora la unión del sustrato sin causar desnaturalización. Superar esta ventana puede desdoblar irreversiblemente la proteína y detener la actividad.
Seleccione un método confiable para cuantificar la formación de producto en cada punto de temperatura. Las opciones comunes incluyen espectrofotometría (que convierte la absorbancia en concentración mediante una curva de calibración) o ensayos de fluorescencia que correlacionan la intensidad con la cantidad de producto.
Combine la enzima y el sustrato en un vial de centelleo sellado para evitar la evaporación. Coloque el vial en un vaso de precipitados más grande con agua y monte el vaso en una placa calefactora. Inserte un termómetro calibrado en el vaso para controlar la temperatura de la solución con precisión.
Comience tomando una alícuota de 100 µl a temperatura ambiente (~25 °C). Active la placa calefactora y recoja muestras de 100 µL a temperaturas incrementales (30,5 °C, 31 °C, 31,5 °C, etc.) hasta alcanzar los 40 °C. Asegúrese de que cada muestra se procese inmediatamente para evitar variaciones de temperatura.
Determine la concentración del producto para cada alícuota utilizando el ensayo elegido. Trazar la concentración (o velocidad de reacción) versus la temperatura. El pico de esta curva identifica la temperatura óptima de la enzima. Las temperaturas superiores a 40 °C suelen mostrar una disminución de la actividad, lo que indica el inicio de la desnaturalización.
