1. Traducción de Nick:
* reacción: Este método utiliza la enzima ADN polimerasa I para reemplazar los nucleótidos en una cadena de ADN con nucleótidos marcados. Funciona introduciendo descansos monocatenarios (Nicks) en el ADN usando DNase I . La polimerasa luego usa el Nick como cebador e incorpora nucleótidos marcados en el espacio.
* isótopos: Los isótopos de uso común son ³²P-DCTP o ³²P-DATP .
* ventajas: Produce una alta actividad específica (densidad de etiqueta) y es adecuado para el ADN de montañismo y doble.
* Desventajas: Requiere una enzima específica y puede ser sensible a las condiciones del tampón.
2. Etiquetado de imprimación aleatoria:
* reacción: Este método utiliza cebadores de oligonucleótidos aleatorios cortos y ADN polimerasa I (Fragmento de Klenow) para sintetizar un nuevo hilo de ADN complementario a la cadena de plantilla. La polimerasa incorpora nucleótidos marcados durante la síntesis.
* isótopos: Los isótopos de uso común son ³²P-DCTP o ³²P-DATP .
* ventajas: Eficiente y se puede usar para etiquetar el ADN monocatenario y doble.
* Desventajas: Puede introducir algún etiquetado de fondo debido a la unión del cebador aleatorio.
3. Marcado final con quinasas:
* reacción: Este método utiliza polinucleótido quinasa Para agregar un grupo de fosfato en el extremo 5 'de un fragmento de ADN. El grupo fosfato está etiquetado con un isótopo radiactivo.
* isótopos: Típicamente ³²P-ATP o ³³P-ATP se usan.
* ventajas: Simple y directo, especialmente útil para etiquetar fragmentos de ADN cortos.
* Desventajas: Solo etiqueta el extremo de 5 'del ADN.
4. Etiquetado de PCR:
* reacción: Este método implica usar dntps radiactivos (como ³²P-DCTP ) durante la reacción de PCR. Esto incorpora la etiqueta en los hilos de ADN recientemente sintetizados.
* isótopos: Los isótopos de uso común son ³²P-DCTP o ³²P-DATP .
* ventajas: Eficiente y se puede usar para etiquetar secuencias de ADN específicas.
* Desventajas: Puede ser menos eficiente que otros métodos y puede ser difícil de obtener una alta actividad específica.
5. Transcripción in vitro:
* reacción: Usa ARN polimerasa para transcribir una plantilla de ADN en ARN. El ARN está marcado con nucleótidos radiactivos durante la síntesis.
* isótopos: Típicamente ³²P-UTP o ³⁵S-UTP .
* ventajas: Puede producir sondas de ARN altamente marcadas para estudios de hibridación.
* Desventajas: Requiere reactivos y condiciones especializadas para la transcripción in vitro.
La elección del método de etiquetado depende de la aplicación específica y de las propiedades deseadas del ADN marcado.
nota: El uso de isótopos radiactivos ha disminuido en los últimos años debido a preocupaciones de seguridad y la disponibilidad de métodos de etiquetado no radioactivo. Sin embargo, el etiquetado radiactivo todavía tiene algunas ventajas en ciertas aplicaciones, particularmente para la sensibilidad y la capacidad de detectar objetivos de baja abundancia.
