19 Método basado en F NMR para la detección de actividad Arf6 GEF. Crédito:Wu Bo
Un equipo de investigación dirigido por el profesor Wang Junfeng de los Institutos de Ciencias Físicas de Hefei (HFIPS) de la Academia de Ciencias de China (CAS) ha desarrollado un nuevo flúor-19 unidimensional (1D) ( 19 F) método basado en resonancia magnética nuclear (RMN) para la detección rápida de la actividad del factor de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) Arf6.
Sus resultados fueron publicados en Analytical Chemistry el 6 de junio.
Las GTPasas pequeñas (sGTPasa) están involucradas en cascadas de señales que controlan una amplia gama de respuestas celulares. Todas las sGTPasas se pueden encontrar en dos estados:un estado inactivo en el que la GTPasa pequeña se une a la guanosina difosfato (GDP) y un estado activo en el que se une a la guanosina trifosfato (GTP). El ciclo de GTPasa formado por la interconversión entre los dos estados está estrictamente regulado por factores de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) y proteínas activadoras de GTPasa (GAP).
La mutación o la regulación anormal de las proteínas sGTPasa o sus GEF/GAP respectivos están estrechamente relacionadas con muchas enfermedades, incluido el cáncer. Por lo tanto, es importante detectar la actividad de estas proteínas GEF/GAP tanto in vitro como in vivo.
En este estudio, los investigadores incorporaron el aminoácido no natural tfmF específicamente para el sitio en Phe47 de sGTPase Arf6, una posición ubicada en el dominio de conmutación ARF6 cuya conformación cambia más durante el ciclo de GTPase. Y desarrollaron el 1D 19 Método basado en F NMR para detectar la actividad GEF en el sistema de proteína purificada o en presencia de lisados celulares.
Para un ensayo de actividad GEF, la muestra de Arf6-F47 tfmF cargado con GDP se colocó en el espectrómetro tan pronto como fue posible después de agregar GEF y GTP. Una serie secuencial de 1D 19 Se recogieron los espectros F NMR. La señal de Arf6-F47 tfmF en el estado unido a GTP fue procesada e integrada. Luego, las curvas cinéticas de intercambio se trazaron y ajustaron a una curva de crecimiento exponencial de una sola fase para extraer la tasa.
"Esta estrategia podría usarse potencialmente para monitorear el cambio conformacional de Arf6 u otra sGTPasa", dijo Wu Bo, primer autor del estudio, "puede detectar las actividades de las proteínas reguladoras de sGTPasas en entornos de fisiología y patología". Los investigadores identifican el mecanismo que controla el tráfico de proteínas celulares
