Por Palmer Owyoung · Actualizado el 24 de marzo de 2022
Las bacterias se cultivan en agar en placas de Petri, formando colonias visibles que representan grupos de células. Si bien un simple recuento de colonias puede proporcionar una estimación rápida de la carga bacteriana, los métodos cuantitativos, como los recuentos viables en placas, arrojan números absolutos e información cualitativa sobre cómo las diferentes condiciones afectan el crecimiento. Debido a que una sola placa puede contener miles de millones de células, el cultivo primero debe diluirse en serie hasta un nivel en el que las colonias individuales puedan contarse de manera confiable.
Comience en un tubo estéril de 1,5 ml. Pipetee 10 µl del cultivo inicial en 90 µl de medio de dilución estéril (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato). Selle el tubo, agite suavemente y tendrá una dilución de 10⁻¹. Repita la transferencia de 10 µL a 90 µL nuevos de medio para generar una dilución de 10⁻², y así sucesivamente. Continúe hasta llegar a una dilución entre 10⁻⁴ y 10⁻¹⁰. Etiquete cada tubo (10‑1, 10‑2,…) para realizar un seguimiento del factor de dilución.
Tome 10 µl del tubo más diluido que aún produzca colonias contables (normalmente entre 30 y 300 por placa). Distribuya el inóculo uniformemente sobre la superficie del agar con un esparcidor de vidrio, gire la placa 90° y repita. Prepare al menos tres placas por dilución para garantizar la confianza estadística. Deje que el esparcidor se seque sobre una llama o una mesa durante unos minutos, luego vuelva a colocar las tapas e incúbelo a la temperatura óptima para el organismo (normalmente 35-37 °C) durante 12-16 h.
Después de la incubación, inspeccione cada placa para ver si hay un número contable de colonias. Marque el fondo del plato (no la tapa) con un marcador permanente en la posición de cada colonia y cuente los puntos. Elija placas que contengan entre 30 y 300 colonias para obtener estadísticas precisas.
Calcule las unidades formadoras de colonias (UFC) por mililitro del cultivo original utilizando la fórmula:
UFC/mL = (número de colonias) × 10×10ⁿ
donde n es el exponente negativo del factor de dilución (por ejemplo, para una dilución de 10⁻⁷, n = 7). El factor 10 representa el volumen de inóculo de 10 µl.
Esterilice el esparcidor en etanol al 70%, enciéndalo con la llama de un mechero Bunsen, deje que el alcohol se queme y enfríelo sobre la superficie de agar seco. Esto mata los microbios residuales antes del recubrimiento.
Maneje todos los cultivos bacterianos como potencialmente peligrosos. Seguir los lineamientos institucionales de bioseguridad y utilizar equipo de protección personal adecuado.
