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La información genética que gobierna todos los organismos vivos reside dentro de las cadenas de ADN de sus cromosomas. Una molécula de ADN es una doble hélice compuesta de nucleótidos:cada nucleótido comprende un grupo fosfato, un azúcar desoxirribosa y una base nitrogenada. Debido a que la columna vertebral de azúcar y fosfato es asimétrica, las dos hebras corren en direcciones opuestas.
La columna vertebral de azúcar-fosfato está formada por una desoxirribosa de cinco carbonos (C1′-C5′). El carbono 5' se une a un grupo fosfato, mientras que el carbono 3' lleva un grupo hidroxilo. Cuando los nucleótidos se unen, el 5' fosfato de un azúcar se une covalentemente al 3' hidroxilo del siguiente, estableciendo una cadena continua 5'→3'. La hebra complementaria corre 3′→5′.
El emparejamiento de bases sigue reglas estrictas:la adenina se empareja con la timina (A‑T) y la citosina con la guanina (C‑G). Estos pares forman los peldaños de la hélice.
Durante la fase S, la helicasa desenrolla la doble hélice y comienza la síntesis de la ADN polimerasa III (en procariotas) o ADN polimerasa δ/ε (en eucariotas). Las polimerasas solo pueden agregar nucleótidos en la dirección 5′→3′, por lo que la cadena orientada 5′→3′ (la cadena principal) se puede copiar continuamente a medida que avanza la bifurcación de replicación. La cadena opuesta, orientada 3′→5′, es la cadena retrasada y debe sintetizarse en segmentos cortos de dirección inversa llamados fragmentos de Okazaki.
Cada fragmento se inicia mediante un cebador establecido por primasa y luego alargado por la polimerasa. Cuando la bifurcación de replicación avanza, se produce el siguiente fragmento y este ciclo se repite hasta que se completa toda la cadena retrasada.
Una vez que se forman todos los fragmentos de Okazaki, la ADN ligasa cataliza la formación de enlaces fosfodiéster entre los extremos adyacentes 3′-OH y 5′-fosfato, produciendo una hebra continua. El resultado son dos hélices dobles idénticas, cada una compuesta por una hebra parental y una hebra recién sintetizada.
