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La clonación molecular es una técnica fundamental de la biología moderna que todo estudiante e investigador debería dominar. Mediante el uso de enzimas de restricción, los científicos cortan el ADN de doble cadena en fragmentos manejables que luego pueden insertarse en un vector plasmídico y expresarse en un huésped bacteriano.
Las enzimas de restricción son endonucleasas que se unen a secuencias cortas específicas de ADN, llamadas sitios de restricción, y escinden el esqueleto de fosfodiéster precisamente en esas posiciones. Con más de 90 enzimas distintas catalogadas, cada una se dirige a una secuencia única y corta su sitio hasta 5000 veces más rápido que cualquier secuencia no reconocida.
Cuando una enzima de restricción se corta, los extremos resultantes pueden ser extremos pegajosos o puntas romas . Los extremos adhesivos contienen salientes monocatenarios que son complementarios entre sí; esta "pegajosidad" impulsa un emparejamiento rápido y específico entre dos fragmentos. Los extremos romos, por el contrario, tienen hebras perfectamente emparejadas sin salientes, lo que las hace menos selectivas durante la ligadura.
Debido a que los extremos adhesivos se emparejan sólo con sus salientes complementarios, el fragmento insertado puede ingresar al plásmido en una orientación única y definida. Los extremos romos no ofrecen ese control direccional, lo que permite que el fragmento se ligue en orientación cabeza-cola o cola-cabeza.
Aunque tanto los extremos pegajosos como los romos requieren en última instancia ADN ligasa para formar una hebra continua, los extremos pegajosos reducen la cantidad de ADN necesaria para una reacción exitosa. Sus salientes complementarios se encuentran entre sí de forma más rápida y eficiente, lo que permite que la ligadura se realice con concentraciones más bajas de inserto y vector.
Por el contrario, los extremos romos deben depender únicamente de la concentración de moléculas de ADN para colisionar y alinearse, lo que a menudo requiere mayores cantidades de entrada para lograr eficiencias de ligadura comparables.
Una de las características más poderosas de las enzimas de extremos pegajosos es que diferentes enzimas pueden generar salientes idénticos, aunque reconozcan secuencias distintas. Por ejemplo, BamHI , BglII y Sau3A todos producen el mismo saliente pegajoso 5'-GATC-3'. Esta redundancia aumenta la probabilidad de que un par de sitios adecuados flanqueen un gen de interés, lo que brinda a los investigadores flexibilidad para elegir la estrategia de restricción óptima.
Los plásmidos diseñados también pueden colocar sitios de restricción adyacentes entre sí, mejorando aún más la versatilidad de los diseños de clonación.
