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Antes de poder secuenciar o editar el ADN, los investigadores primero deben aislarlo de la matriz celular. Aunque las células contienen una mezcla de proteínas, lípidos, carbohidratos y moléculas pequeñas, las propiedades químicas únicas del ADN permiten separarlo y purificarlo para su posterior análisis.
El paso inicial en cualquier flujo de trabajo de extracción de ADN es la lisis celular. Dependiendo del tipo de muestra y la pureza requerida, los laboratorios eligen entre métodos mecánicos, enzimáticos o basados en detergentes. Los detergentes solubilizan las membranas celulares, las ondas ultrasónicas de alta frecuencia (sonicación) rompen las membranas mediante cavitación y el batido de perlas (donde las perlas de vidrio vibran contra la muestra) proporciona una alteración física rápida que libera ácidos nucleicos.
Cuando la velocidad supera la pureza, los científicos a veces emplean una limpieza mínima. La adición de proteinasa K degrada la mayoría de las proteínas, lo que permite utilizar la muestra con una purificación suave. Alternativamente, las altas concentraciones de sal (p. ej., acetato de amonio o potasio) precipitan las proteínas, pero muchos otros contaminantes permanecen. Estos métodos son adecuados para la detección rápida, pero no para aplicaciones que requieren ADN de alta calidad.
La extracción con fenol-cloroformo sigue siendo una técnica clásica, aunque ahora es menos común debido a la toxicidad y la intensidad del trabajo. Las células se lisan con detergente y luego se mezclan con una mezcla de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico. Tras la centrifugación, la solución se separa en una fase acuosa (abajo) que retiene el ADN y una fase orgánica (arriba) que captura proteínas y lípidos. El control cuidadoso de la concentración de sal y el pH es esencial para una recuperación óptima. Debido a que el fenol y el cloroformo son peligrosos, muchos laboratorios han optado por alternativas más seguras.
La cromatografía de intercambio aniónico ofrece mayor pureza y reproducibilidad. La matriz de la columna contiene grupos cargados positivamente que se unen al ADN cargado negativamente. Las proteínas, el ARN y otros contaminantes se eliminan por lavado y posteriormente el ADN se eluye con un tampón con alto contenido de sal. Este método es especialmente valioso para la purificación a escala preparativa.
Los kits de columnas de hilado a base de sílice se han convertido en el estándar de oro para la purificación de ADN rápida y reproducible. El ADN se une a una membrana de sílice en presencia de sales caotrópicas, mientras que los contaminantes se eliminan por lavado. Después de un enjuague final bajo en sal, el ADN se eluye en un pequeño volumen de TE o agua, lo que produce material de alta calidad en minutos.
Después del aislamiento, la solución de ADN normalmente se coloca en un tampón con pH controlado. Su pureza se verifica midiendo la absorbancia ultravioleta a 260 nm y 280 nm. Una proporción de 260/280 de ~1,8 indica una alta pureza, mientras que proporciones más bajas sugieren contaminación de proteínas. La absorbancia a 260 nm también proporciona una estimación sencilla de la concentración de ADN.
