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En los primeros días de la ingeniería genética, la idea de injertar rasgos de un organismo en otro parecía descabellada. Hoy, sin embargo, insertar ADN extraño en el genoma de un huésped es un proceso rutinario, ya sea agregando genes resistentes a plagas al maíz, expresando insulina humana en bacterias o modelando cánceres humanos en ratones. Si bien los detalles técnicos pueden ser complejos, la secuencia general de pasos sigue siendo consistente y lógica.
Comience tratando el ADN plasmídico y el fragmento de ADN extraño con una enzima de restricción elegida. Estas enzimas reconocen motivos básicos específicos y realizan cortes precisos, generando extremos compatibles para la ligadura posterior. Las enzimas de restricción se derivan naturalmente de los sistemas de defensa bacterianos que escinden el ADN viral invasor.
A continuación, mezcle la columna vertebral del plásmido digerido con el ADN extraño escindido y agregue la ADN ligasa. Los extremos pegajosos complementarios resultantes se hibridan y la ligasa sella las muescas, produciendo plásmidos circulares que transportan el segmento de ADN insertado.
Introduzca los plásmidos recombinantes en células bacterianas competentes y permita que se recuperen. Aquellas colonias que hayan absorbido el plásmido crecerán en medios selectivos que contengan el antibiótico adecuado, gracias al marcador de resistencia codificado en el plásmido. La transformación se puede lograr mediante choque térmico, electroporación o competencia química, dependiendo de la cepa bacteriana.
Coseche células de colonias individuales, líselas con un tampón detergente para liberar ADN plasmídico y luego desnaturalice las hebras mediante tratamiento térmico o alcalino. Esto prepara el ADN para el análisis posterior.
Hibride el ADN extraído con una sonda marcada con fluorescencia complementaria a la secuencia insertada. Exponer la muestra a iluminación UV; Las regiones de coincidencia perfecta emitirán fluorescencia, confirmando la presencia del gen extraño.
Seleccione las colonias que dieron positivo para el inserto, amplíelas y aísle el ADN del plásmido. Amplifique el plásmido, si es necesario, mediante PCR para generar material suficiente para análisis posteriores o aplicaciones posteriores.
