Proteínas de membrana interna (Imps) :Estas proteínas están integradas dentro de la membrana interna de E. coli, una bicapa fosfolípida que encierra el citoplasma. Juegan papeles cruciales en varias funciones celulares, que incluyen:
* Transporte: Facilitar el movimiento de nutrientes, iones y productos de desecho a través de la membrana.
* Transducción de señal: Relmitiendo las señales del entorno al interior de la célula.
* Metabolismo energético: Participando en procesos como el transporte de electrones y la síntesis de ATP.
Proteínas de membrana externa (OMPS) :Estas proteínas se encuentran en la membrana externa de E. coli, una segunda bicapa de fosfolípidos que rodea la membrana interna y proporciona soporte y protección estructural. Están involucrados en:
* Formación porin: Creación de canales que permiten el paso de moléculas pequeñas.
* Actividad del receptor: Unión a moléculas específicas y desencadenando respuestas celulares.
* Adhesión: Unirse a superficies u otras celdas.
Aquí hay un enfoque general para separar estos tipos de proteínas de E. coli:
1. Lisis celular:
* lisis mecánica: Use métodos como Sonication o French Press para interrumpir la pared celular y liberar el contenido de la celda.
* Lisis química: Utilice detergentes como Triton X-100 o SDS para disolver los lípidos de membrana.
2. Centrifugación diferencial:
* Centrifugación de baja velocidad (10,000 x g): Este paso elimina los restos celulares, incluidas las células ininterrumpidas y los grandes componentes celulares.
* Centrifugación de alta velocidad (100,000 x g): Este paso separa las membranas internas y externas del citoplasma soluble. Se recoge el sedimento que contiene ambas membranas.
3. Fraccionamiento de membrana:
* Centrifugación de gradiente de sacarosa: Este método separa las membranas en función de su densidad. La membrana externa es típicamente menos densa que la membrana interna, lo que permite su separación.
* Triton X-114 Partitioning de fase: Esta técnica utiliza un detergente no iónico para separar las proteínas basadas en su hidrofobicidad. Los IMP son más hidrófobos que las OMP, lo que lleva a su división en la fase rica en detergente.
4. Purificación:
* Cromatografía de afinidad: Esta técnica utiliza ligandos específicos que se unen a la proteína objetivo, lo que permite su separación de otras proteínas.
* cromatografía de intercambio iónico: Este método separa las proteínas en función de su carga.
* Cromatografía de exclusión de tamaño: Esta técnica separa las proteínas en función de su tamaño.
5. Confirmación:
* SDS-PAGE: Esta técnica de electroforesis separa las proteínas en función de su peso molecular.
* Western Blotting: Esta técnica utiliza anticuerpos para detectar proteínas específicas.
Notas importantes:
* El protocolo específico dependerá de la proteína objetivo y sus propiedades.
* La optimización de cada paso es crucial para obtener proteínas puras y funcionales.
* Las técnicas como la espectrometría de masas se pueden usar para un análisis posterior de las fracciones de proteínas separadas.
Kits comerciales:
Hay varios kits comerciales disponibles para aislar las proteínas de membrana interna y externa de E. coli, lo que puede simplificar el proceso.
Siguiendo estos pasos y eligiendo las técnicas apropiadas, los investigadores pueden separar con éxito y purificar proteínas de membrana interna y externa de E. coli, lo que permite un análisis más detallado de su estructura, función e interacciones.
