Distintas biomoléculas interactúan específicamente en procesos celulares y conducen a respuestas celulares específicas. Esto a menudo se logra dirigiendo biomoléculas a compartimentos subcelulares. Los compartimentos como las mitocondrias están separados espacialmente por membranas. Otros, como los nucléolos, no tienen ningún límite de membrana.

Cómo se forman estos compartimentos sin membranas sigue siendo uno de los mayores misterios de la biología. En los últimos años, se ha propuesto un fenómeno llamado separación de fases líquido-líquido (LLPS) como la fuerza impulsora del ensamblaje de compartimentos.

El grupo de Andrea Musacchio, director del Instituto Max Planck de Fisiología Molecular, ha desarrollado una estrategia de validación para evaluar el papel del LLPS en la formación de compartimentos y evaluar métodos comunes para detectar las propiedades del LLPS. El estudio se publica en la revista Molecular Cell. .

La aplicación de la estrategia al proceso de ensamblaje del centrómero durante la división celular, que se propuso que fuera impulsado por un andamio LLPS (el complejo cromosómico pasajero o CPC), no logró identificar el LLPS como un impulsor crucial, lo que confirma el bajo poder predictivo de estos ensayos. . Esta nueva estrategia tiene el potencial de convertirse en una herramienta importante para validar el papel de otros posibles impulsores de LLPS identificados hasta ahora.

Las proteínas, que cumplen la mayoría de las funciones en nuestro cuerpo al interactuar con otras proteínas, se enfrentan a un dilema:se mueven por la célula con 40 millones de posibles compañeros de interacción.

Por lo tanto, encontrar la pareja adecuada puede parecer como buscar una aguja en un pajar. Sin embargo, si la probabilidad de que una proteína encuentre por casualidad a la pareja adecuada en el momento adecuado puede parecer baja, la célula ha encontrado una estrategia para reunir proteínas que se asemeja a encontrar una pareja potencial en el trabajo, en un café o en el club:espacial Las señales guían a las proteínas hacia compartimentos celulares definidos, como la membrana plasmática o la mitocondria.

El proceso de división celular, por ejemplo, se inicia mediante procesos de señalización en la membrana celular, que activan enzimas cuyas señales finalmente llegan al núcleo celular para desencadenar la transcripción genética específica.

Durante la división celular posterior, una multitud de interacciones proteicas específicas conducen a la formación de un complejo proteico multicapa en los centrómeros de los cromosomas, que garantiza una distribución sin errores de los cromosomas en una célula madre a sus dos hijas.

La naturaleza ha desarrollado una determinada química para las proteínas que interactúan:las proteínas destinadas entre sí están equipadas con interfaces evolutivamente conservadas y expuestas con identidades químicas detalladas en su estructura 3D que son complementarias entre sí. Estos motivos se encuentran en todas las especies y permiten interacciones de proteínas altamente específicas.

¿Un cambio de paradigma?

A principios del siglo pasado se observaron por primera vez los primeros compartimentos celulares no delimitados por fronteras físicas. Ahora sabemos que los nucléolos, los cuerpos P o los gránulos de estrés concentran macromoléculas, principalmente proteínas y ARN, y tienen funciones importantes en la célula.

El descubrimiento de estos compartimentos sin membranas ha abierto un nuevo campo de investigación lleno de preguntas sin respuesta, la más desafiante de las cuales es cómo se forman estos compartimentos y cómo mantienen su estructura.

En los últimos años, ha ganado un impulso considerable la idea de que estos compartimentos se forman mediante un proceso llamado desmezcla líquido-líquido o separación de fases líquido-líquido, comparable a la formación espontánea de gotas de aceite en el agua.

Según este punto de vista, los compartimentos sin membrana son "condensados" cuya formación se basa en interacciones transitorias, débiles e inespecíficas de proteínas "conductoras", lo que finalmente provoca su acumulación allí en concentraciones más altas que en el medio circundante.

Los ensayos que investigan las propiedades de separación de fases de las proteínas fuera de la célula han identificado docenas de estos impulsores hasta la fecha, incluido el complejo cromosómico pasajero (CPC), del que se afirma que forma condensados ​​en el centrómero para modular su organización y función durante la mitosis.

In vitro no es in vivo:No se puede descuidar el citosol

"Para muchos científicos, la separación de fases se ha convertido en la explicación predeterminada para la formación de compartimentos sin membrana. Sin embargo, hay poca evidencia de que los ensayos LLPS realizados in vitro puedan realmente predecir un proceso fisiológico en el entorno celular", dice Musacchio.

Junto con su equipo, desarrolló una estrategia para evaluar un ensayo LLPS ampliamente utilizado y su poder predictivo, y lo aplicó al CPC.

"En nuestra opinión, una debilidad importante de los ensayos es que no modelan el disolvente con suficiente precisión. El disolvente define la solubilidad de una proteína y, por tanto, su capacidad para interactuar con otras proteínas".

Para imitar lo más fielmente posible el entorno natural de la célula, el científico añadió lisados ​​de células bacterianas o de mamíferos diluidos a tampones LLPS estándar. Incluso en concentraciones muy diluidas, los lisados ​​impidieron por completo la formación de condensados. Para evaluar cuán general era esto, los científicos repitieron el mismo experimento con varias proteínas adicionales, todas las cuales mostraron propiedades LLPS en el ensayo estándar. Y, de hecho, en todos los casos la adición de lisados ​​celulares disolvió los "condensados".

"Estos resultados confirman nuestra suposición de que el entorno celular amortigua eficazmente las interacciones débiles inespecíficas que se cree que causan LLPS in vitro", afirma Musacchio.

Escaso poder predictivo

Las interacciones y funciones de las proteínas en la célula están fuertemente reguladas por las llamadas modificaciones postraduccionales. La adición o eliminación selectiva de grupos fosfato en lugares críticos, por ejemplo, puede alterar la interacción entre dos proteínas con un efecto inmediato. Estas modificaciones naturales pueden imitarse en el laboratorio mediante mutaciones y son el método elegido cuando se trata de investigar muchos procesos celulares.

Al introducir mutaciones en cuatro residuos implicados en el reconocimiento de señales fosforiladas, el científico generó un mutante de CPC que no puede reclutarse en los centrómeros y no se acumula allí. Sin embargo, este mutante aún mostró potencial completo de LLPS en el ensayo in vitro, lo que demuestra que el ensayo no puede predecir la localización y función de CPC.

"Nuestros resultados muestran que el LLPS de un solo componente in vitro no puede predecir la solubilidad y localización en el entorno complejo y abarrotado de la célula. La lista de supuestos andamios de LLPS identificados a través de los ensayos establecidos necesitará un reexamen exhaustivo, y la estrategia de validación que que presentamos aquí puede guiar este esfuerzo", afirma Musacchio.

"En el futuro, planeamos repetir nuestros experimentos con muchos supuestos andamios de LLPS, especialmente aquellos que se han convertido en buques insignia en el crecimiento del campo de LLPS. Nuestros experimentos muestran que el citosol es un potente disolvente cuyo papel no puede descuidarse. Por lo tanto, Será importante generar medios citomiméticos apropiados como estándares para evaluar reacciones bioquímicas in vitro. Intentaremos contribuir a esta área de investigación."