Este protocolo describe un método común para medir la actividad de nitrato reductasa usando nitrito de sodio como estándar.
Materiales:
* Material vegetal: Hojas frescas, raíces u otros tejidos que contienen nitrato reductasa.
* búfer de extracción:
* Buffer Tris-HCl 100 mm, pH 7.5
* 1 mm EDTA
* 10 mm DTT (dithiothreitol)
* 0.1% (p/v) albúmina de suero bovino (BSA)
* Mezcla de reacción:
* Tampón de fosfato de potasio 100 mM, pH 7,5
* 10 mm de nitrato de sodio
* 1 mm nadh
* Solución estándar de nitrito de sodio: Prepare una solución estándar de concentración conocida (por ejemplo, 100 ppm).
* reactivo Griess: (Consulte instrucciones de protocolo específicas)
* Espectrofotómetro: Para medir la absorbancia a 540 nm.
* Centrifuge: Para separar los restos celulares.
* Baño de hielo: Para mantener temperaturas frías.
* pipetas y consejos: Para mediciones de volumen precisas.
Procedimiento:
1. Preparación de la muestra:
* Cosecha material vegetal y enjuague rápidamente con agua destilada fría.
* Pese una cantidad adecuada de tejido (por ejemplo, 0.1-1 g) y muele en un mortero y mano con mazón con nitrógeno líquido o usando un homogeneizador en tampón de extracción.
* Centrifuge el homogeneizado a 10,000 g durante 10 minutos a 4 ° C para eliminar los restos celulares. El sobrenadante es tu extracto enzimático.
2. Ensayo de nitrato reductasa:
* Prepare una serie de tubos que contengan la mezcla de reacción, incluidos los espacios en blanco sin extracto de enzimas y tubos con concentraciones variables de nitrito de sodio.
* Agregue un volumen apropiado de extracto de enzima a los tubos de reacción.
* Comience la reacción agregando NADH.
* Incubar los tubos a 30 ° C durante un tiempo específico (por ejemplo, 30 minutos).
* Terminar la reacción agregando reactivo Griess.
3. Medición de la producción de nitrito:
* Incubar los tubos en la oscuridad durante al menos 15 minutos para permitir el desarrollo del color.
* Mida la absorbancia a 540 nm usando un espectrofotómetro.
* Prepare una curva estándar utilizando las concentraciones conocidas de nitrito de sodio.
* Calcule la cantidad de nitrito producido por el extracto de enzima usando la curva estándar.
4. Cálculo de la actividad de nitrato reductasa:
* Exprese la actividad de nitrato reductasa como µmol de nitrito producido por minuto por gramo de peso fresco (FW) o proteína .
nota:
* Este protocolo es un esquema básico, y pueden ser necesarias modificaciones específicas dependiendo de las especies de la planta y la configuración experimental.
* Asegúrese de que todas las soluciones se preparen frescas y almacenadas adecuadamente.
* Use reactivos de alta calidad para obtener resultados precisos.
* Control para la absorbancia de fondo midiendo la absorbancia de los espacios en blanco sin extracto enzimático.
* Repita el ensayo al menos tres veces para garantizar la reproducibilidad.
reactivo Griess:
* El reactivo Griess se usa para detectar el nitrito al reaccionar con él para producir un tinte azo de color púrpura.
* Se pueden usar diferentes reactivos de Griess, así que consulte el protocolo específico para la preparación y el uso.
Métodos alternativos:
* Otros métodos para medir la actividad de nitrato reductasa incluyen el uso de nitrato como sustrato y detectar la reducción de nitrato a nitrito.
* Medición espectrofotométrica Se puede emplear para medir directamente el cambio en la concentración de NADH con el tiempo.
Interpretación:
La actividad de nitrato reductasa es un indicador de la capacidad de la planta para reducir el nitrato a nitrito, que es un paso crucial en la asimilación de nitrógeno. Comparar la actividad en diferentes tejidos o en diferentes condiciones puede revelar información valiosa sobre el metabolismo de nitrógeno de la planta.
Más información:
* Modificaciones del protocolo para especies o condiciones de plantas específicas: Consulte la literatura científica relevante o los expertos en contacto para obtener orientación.
* Solución de problemas: Consulte las guías de solución de problemas o consulte a expertos si se encuentra con algún problema con el ensayo.
Este protocolo proporciona un marco general para medir la actividad de nitrato reductasa utilizando nitrito de sodio como estándar. Adaptarlo a sus necesidades específicas y garantizar resultados precisos.
