Un espécimen fósil de T.rex (AMNH 5027) en exhibición en el Museo Americano de Historia Natural, en 2019. Crédito:Museo Nacional de Historia Natural, Nueva York. amnh.org/exhibitions/permanent/saurischian-dinosaurs/tyrannosaurus-rex.
La noción existente de que las arquitecturas de tejidos blandos y las proteínas nativas se pueden preservar a lo largo del tiempo geológico es controvertida, ya que los métodos de tal preservación aún deben investigarse y definirse bien. En un nuevo estudio, Elizabeth M. Boatman y colegas de los departamentos de ingeniería, Paleontología, Ciencia biológica, Materiales e ingeniería y la fuente de luz avanzada en EE. UU., probados mecanismos de reticulación para la arquitectura tisular preservada. Utilizaron dos no enzimáticos, mecanismos proteicos estructurales, La química y la glicación de Fenton para demostrar sus posibles contribuciones a la preservación de las estructuras de los vasos sanguíneos recuperadas del hueso cortical de tirano-saurio Rex ( Tirano saurio Rex ; USNM 555 000, anteriormente MOR 555). Demostraron la endogeneidad (aleatoriedad) de los tejidos de los vasos fósiles y la presencia de colágeno tipo I en las capas más externas de los vasos mediante imágenes. difracción, espectroscopia e inmunohistoquímica.
Derivaron datos de estudios infrarrojos por transformada de Fourier sincrotrón (SR-FTIR) en el Tirano saurio Rex recipientes para analizar su carácter de reticulación y compararlos con muestras de pollos de control tratadas de manera similar con las dos técnicas. Los investigadores proporcionaron análisis de microsonda de rayos X del estado químico de los tejidos fósiles para apoyar la preservación de los vasos de Tirano saurio Rex , como se observa utilizando los métodos de investigación. Boatman y col. proponen que los enlaces cruzados estabilizadores de tejidos observados jugarán un papel importante para preservar tejidos microvasculares adicionales en elementos esqueléticos de la era Mesozoica. El trabajo ahora está publicado en Informes científicos .
Los paleontólogos han recuperado huecos, estructuras similares a vasos flexibles y transparentes de elementos esqueléticos de vertebrados fósiles, incluidos dinosaurios no aviares, y aplicaron muchas técnicas para identificar sus proteínas endógenas, como el colágeno y la elastina. Los investigadores habían utilizado la secuenciación por espectroscopia de masas para identificar vasos aislados recuperados de dinosaurios no aviares para respaldar la presencia de proteínas vasculares específicas de vertebrados en el pasado. Por ejemplo, documentaron el patrón característico de bandas de 67 nanómetros típico del colágeno tipo I después de liberar la proteína a través de la desmineralización, seguido de estudios adicionales para verificar la presencia de colágeno tipo I en los canales vasculares de una costilla de dinosaurio saurópodo de hace aproximadamente 190 millones de años utilizando análisis FTIR y Raman. Si bien los equipos de investigación habían desarrollado una variedad de métodos para explicar la preservación inesperada, Las pruebas experimentales de los mecanismos propuestos quedan por realizar de forma rutinaria y amplia.
En el presente trabajo, Boatman y col. identificó y probó la posible contribución de un conjunto de experimentos para preservar la arquitectura en forma de vaso del hueso compacto de un tirano-saurio Rex fósil. Esperan que el trabajo sienta las bases para estudios adicionales sobre la preservación de tejidos blandos recuperados del Mesozoico o fósiles más recientes. Las paredes de los vasos sanguíneos de los vertebrados contienen tres capas distintas, incluida la túnica íntima (la más interna), tunica media y tunica externa (capa más externa). Debido a sus composiciones moleculares únicas, los científicos pueden diferenciar los componentes morfológica y químicamente. Por ejemplo, la elastina es una proteína helicoidal específica de los vertebrados que ofrece resistencia a los cambios de presión en las paredes vasculares. El colágeno también es específico de los vertebrados y constituye una fracción predominante de los vasos sanguíneos que sirven como base estructural. Dado que la elastina y el colágeno contienen características distintivas identificables en la estructura y composición molecular, Boatman y col. propuso estudiar las dos proteínas dentro de los vasos de dinosaurios remanentes.
IZQUIERDA:análisis SR-FTIR. Localización de subbanda de amida I de colágeno de tipo I de pollo tratado y no tratado en espectros SR-FTIR. Subbandas (hoja β, ~ 1633 cm − 1; triple hélice, ~ 1658-1660 cm − 1; intermolecular ~ 1683-1690 cm − 1) se indican en las figuras. Los trazos rojos denotan segundas derivadas de curvas experimentales. Aunque la subbanda intermolecular se presenta típicamente en un número de onda más bajo, el valor identificado fue el mínimo local más cercano en cada una de las trazas de la segunda derivada y aparece consistentemente en todas las muestras; por lo tanto, en esta muestra, la subbanda intermolecular se indexó en 1697-1699 cm − 1. DERECHA:Imágenes SEM del hueso cortical USNM 555000. (a) Superficie de fractura que muestra características claras de osteonas (o) predominantemente en la sección longitudinal, lagunas de osteocitos (ol; en círculos blancos discontinuos), y textura fina consistente con fibras de colágeno mineralizado en el hueso. Imagen retrodispersada (BSE). (B), Sección transversal pulida (grano 1200) (imagen BSE) que muestra características claras de osteonas y lagunas de osteocitos. Los osteones rellenos de minerales (flechas blancas) producen estructuras vasculares muy alteradas, que fueron fácilmente eliminados de SAXS, FTIR, y análisis TEM mediante una preparación cuidadosa (sedimentación, Lavado, selección bajo microscopio). Las grietas se deben a cambios de humedad / presión y son un artefacto de preparación. (C), Sección transversal pulida (grano 1200) (imagen de electrones secundarios [SE]) que muestra características claras de osteones y lagunas de osteocitos. (D), Imagen SE muy ampliada de una osteona, mostrando textura fibrosa en los bordes (flecha blanca), que se observó comúnmente en osteones rellenos no minerales en esta muestra. Esta delgada Se propone que el revestimiento fibroso dentro de la estructura del osteón sea el hueco, estructuras vasculares flexibles. Crédito: Informes científicos , doi:10.1038 / s41598-019-51680-1
El equipo de investigación planteó la hipótesis de la contribución de los primeros procesos diagenéticos (físicos y químicos) a la supervivencia de Tirano saurio Rex microvasculatura de tiempo profundo. Para probar esto, Boatman y col. realizó por primera vez el análisis SR-FTIR para comprender el carácter de entrecruzamiento en su muestra de control de proteína de colágeno tipo I de pollo. Indujeron reticulaciones en la proteína usando reactivo de Fenton o técnicas de glicación catalizadas por iones seguidas del uso de transmisión SR-FTIR para probar cada tejido. Observaron que los enlaces cruzados intramoleculares formados en los tejidos de pollo eran inmaduros debido a su falta de exposición a las vías necesarias para formar enlaces cruzados intermoleculares o productos finales de glicación avanzada (AGE).
Para probar el Tirano saurio Rex arquitectura de vasos para proteínas endógenas, los científicos liberaron tres tipos de recipientes de un desmineralizado Tirano saurio Rex Hueso cortical. Luego utilizaron microscopía de luz visible (VLM) para caracterizarlos como:
Combinaron espectroscopía de rayos X de dispersión de energía (EDS) con microscopía electrónica de barrido (SEM), así como espectroscopía de fluorescencia de rayos X microenfocada (µXRF) para confirmar las diferencias observadas en las muestras de tejido de composición variable. El equipo se centró en las redes de vasos flexibles debido a su tejido óseo similar al existente, que presumiblemente mantuvo una alteración mínima.
IZQUIERDA:Imágenes microscópicas de tejido vascular de T. rex y análisis asociado de bandas de colágeno fibrilar. (a) El VLM transmitido del tejido blando de T.rex muestra una extensa red de huecos, flexible, estructura vascular y tonalidad parda típica. (b) Imagen SEM de la superficie de un buque. (c) Imagen ampliada de (b) detalles de características consistentes con haces de fibras de colágeno (fibrilla de colágeno, "F"; fibra de colágeno, "CF"). El ancho promedio de las fibrillas se midió como 110 nm, y ancho medio de fibra, 1,0 μm. (d) Imagen TEM de las características fibrosas observadas en una sección transversal de un vaso longitudinal. Perfiles de intensidad de textura en bandas en (e) casillas 1 y 2 en cy (f) casillas 3, 4, 5 en (d) con ejemplos de distancias pico a pico (promedio SEM, ~ 74 nm; TEM, ~ 56 nm) en rojo. DERECHA:Imágenes y análisis químico de lo orgánico, Vasos de Tyrannosaurus rex de color marrón y moldes mineralizados del sistema de vasos liberados tras la desmineralización del tejido. (a), Imagen de microscopía óptica de fragmentos de vasos típicos liberados de T. rex. (B), Imagen ampliada de un rectángulo blanco en una, representando tonos marrones, flexible, fragmentos de vasijas orgánicas (ov) y dos tipos de moldes mineralizados:formas opacas y formas semitranslúcidas. (C), Imagen SEM de fragmentos de vasos similares. (D), Imagen ampliada de rectángulo blanco en c, con tres tipos de fragmentos de vasos identificados y las ubicaciones del análisis EDS en e identificadas explícitamente. (mi), El análisis EDS identificó los moldes opacos del recipiente como una forma de óxido de hierro (parte inferior, rojo) y el vaso semitranslúcido se proyecta como BaSO4 (arriba, azul). Crédito: Informes científicos , doi:10.1038 / s41598-019-51680-1
Cuando Boatman et al. estudió el maleable Tirano saurio Rex buques que utilizan SEM, observaron estructuras fibrosas a lo largo de su superficie más externa. Las características combinadas fueron consistentes con las observadas en los vasos existentes liberados del hueso cortical y con colágeno fibrilar. El equipo analizó el espectro SR-FTIR de Tirano saurio Rex vasos para detectar las bandas dominantes observadas en tejidos antiguos y existentes tratados. Notablemente, la banda de amida I para el tejido de dinosaurio estaba ubicada en una estructura de hélice α predominante consistente con colágeno fibrilar maduro (reticulado). Luego, el equipo de investigación realizó estudios de inmunohistoquímica (IHC) para identificar epítopos específicos de proteínas de las proteínas estructurales elastina y colágeno tipo I.
Los científicos generaron anticuerpos contra todos los componentes de la vasculatura existente para observar la unión positiva en las paredes de los vasos de los dinosaurios. Usando un filtro fluorescente, capturaron la localización y distribución de complejos anticuerpo-antígeno (fluorescencia verde). La respuesta de los vasos de los dinosaurios a los anticuerpos de actina apareció como una capa delgada y uniformemente distribuida. Los anticuerpos producidos contra la proteína muscular tropomiosina aparecieron con mayor intensidad en las paredes de los vasos. Los vasos de dinosaurio también indicaron la presencia de anticuerpos de colágeno tipo I, aunque los anticuerpos de elastina mostraron mayor intensidad. Las dos proteínas fueron buenos objetivos para los estudios fósiles debido a la alta conservación evolutiva en ciertas regiones. No observaron reactividad de los vasos de los dinosaurios a los anticuerpos contra el peptidoglicano bacteriano (lo que indica que no hay contaminación microbiana).
Los tejidos de T. rex exhiben unión positiva de anticuerpos a componentes proteicos del tejido vascular existente. (a, C, mi, gramo, I, k, metro, o) Son imágenes compuestas en las que la fluorescencia correspondiente a los complejos anticuerpo-antígeno se superpone a las imágenes VLM de secciones de vasos, con imágenes adyacentes (b, D, F, h, j, yo norte, p) capturado con un filtro fluorescente. (a – d) No se observó unión espuria para los controles negativos en los que los vasos estuvieron expuestos a anticuerpos secundarios producidos contra la especie hospedadora de todos los demás anticuerpos utilizados, es decir., ratón (a, b) y conejo (c, D). (mi, f) La unión positiva de los vasos de los dinosaurios a los anticuerpos de actina se puede ver en capas distribuidas uniformemente, y G, h) la unión distribuida más ampliamente es evidente para los anticuerpos de tropomiosina muscular. Anticuerpos para ambos (i, j) colágeno tipo I y (k, l) la elastina se une positivamente a estos vasos de T. rex. (metro, n) Los anticuerpos producidos contra la hemoglobina de avestruz exhiben una intensidad de unión comparativamente más baja. (o, p) No se observó reactividad de los vasos de los dinosaurios a los anticuerpos contra el peptidoglicano bacteriano (lo que indica que no hay contaminación). Crédito: Informes científicos , doi:10.1038 / s41598-019-51680-1
Boatman y col. probado Tirano saurio Rex estructuras vasculares para comprender si el entrecruzamiento de proteínas estructurales post-mortem mejora su resistencia a la degradación o alteraciones diagenéticas. Para esto, se centraron en el colágeno fibrilar utilizando espectros de transmisión SR-FTIR para sugerir la reticulación post-mortem durante el proceso de preservación de la arquitectura tisular. Estas características espectrales se registraron previamente, pero no se discutieron con los sauropodomorfos del Jurásico temprano y los huesos del Cretácico. Los científicos luego trataron a granel Tirano saurio Rex tejido con borohidruro de sodio (NaBH 4 ) para reducir los grupos carbonilo dentro de reticulaciones inmaduras y aumentar la intensidad de absorción de carbonilo no peptídico. Las bandas de absorción de carbohidratos en el Tirano saurio Rex los tejidos eran compatibles con los AGE (productos finales de glicación avanzada). Después del tratamiento, los datos sugirieron que Tirano saurio Rex los tejidos poseían tipos de reticulación intramolecular e intermolecular.
Cuando los científicos mapearon los elementos en el tejido usando µXRF, revelaron hierro (Fe) como el único metal concentrado dentro de los tejidos de los vasos de los dinosaurios mientras registraban el bario (Ba) dentro de los moldes semitranslúcidos de los vasos. Utilizando microscopía de estructura cercana al borde de absorción de micro-rayos X extendida, observaron Fe 3+ incrustado en las paredes del recipiente. Los investigadores mostraron la presencia de goethita finamente cristalina (α-FeO (OH)); un mineral previamente detectado en tejidos vasculares recuperado de dos diversos especímenes de dinosaurios.
ARRIBA:Análisis SR-FTIR del tejido vascular de T.rex, NaBH4 redujo el tejido vascular de T.rex, colágeno de pollo tipo I sin tratamiento, y colágeno tipo I de pollo tratado con reactivo de Fenton y glicación catalizada por hierro. (a, b) Espectros promedio de FTIR en las regiones de carbonilo no peptídico y amida de proteína I para las cinco muestras. (a) Una reducción significativa de la banda de carbonilo no peptídica sigue al tratamiento del tejido vascular de T.rex con NaBH4, que reduce los enlaces cruzados de péptidos (inmaduros). La banda Amida I cambiada al azul del tejido de dinosaurio, Colágeno de pollo tipo I tratado con reactivo Fenton, y el colágeno de tipo I de pollo tratado con glicación catalizada por Fe indican un aumento de la estructura de hélice α (~ 1660 cm − 1) a medida que las subbandas intermoleculares y de triple hélice de mayor energía predominan cada vez más en los espectros. El desarrollo de carbonilo aldehídico, cetoaldehído, y / o bandas de cetoimina inmaduras en ambos tejidos de pollo tratados es consistente con la banda de carbonilo fuerte en el tejido de dinosaurio. INFERIOR:El mapeo de micro-fluorescencia de rayos X (u-XRF) de los tejidos orgánicos y mineralizados de los vasos del Tyrannosaurus rex revela la presencia de múltiples metales. S, Fe, y Ba fueron los elementos principales identificados en las muestras de recipientes. Mapas compuestos de dos (a, b muestran Ba y Fe) y tres (c, d mostrar S, Licenciado en Letras, y Fe) las especies atómicas muestran que el Fe está predominantemente asociado con los tejidos orgánicos de los vasos, mientras que S y Ba están asociados principalmente con los moldes de vasijas mineralizadas semitranslúcidas. Crédito: Informes científicos , doi:10.1038 / s41598-019-51680-1
De este modo, Elizabeth M. Boatman y sus colegas demostraron la presencia de proteínas endógenas de especies de vertebrados dentro de las estructuras de los dinosaurios de tejidos blandos. Esto incluyó la presencia de colágeno tipo I compatible con la vasculatura en los vertebrados existentes. Los datos respaldaron un mecanismo de dos pasos que estabilizó las biomoléculas y la arquitectura de los vasos después de la muerte del organismo. para promover su preservación dentro de los elementos esqueléticos. The team hypothesized that iron-mediated Fenton and glycation pathways may have contributed to enhanced T. rex tissue longevity of elastin and fibrillar collagen within and around blood vessels. Both processes could be catalyzed by transition metal species such as iron to define the central role of Fe observed in structural protein crosslinking. The formation of iron oxyhydroxide precipitates in the work fully supported this idea.
The data represent the first comprehensive chemical and molecular characterization of vascular tissues recovered from T. rex specimen USNM 555000. The results shed light on the possible processes of fossilization at the molecular level. The researchers envision the demonstrated techniques will contribute to the development of comprehensive mechanisms to consistently retain vascular tissue survival from deep time.
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