La capacidad de hacer crecer grandes cristales de proteínas es el mayor cuello de botella que limita el uso de la cristalografía de proteínas de neutrones en biología estructural. Los cristales de proteína deben tener volúmenes en la región de al menos 0,1 mm ³ . En teoría, no hay ninguna razón en particular por la que no se puedan cultivar cristales de este tamaño. Si pueden ser La cristalografía de proteínas de neutrones puede proporcionar información crucial sobre la ubicación de los átomos de hidrógeno, detalles relacionados con la hidratación, los enlaces de hidrógeno y las interacciones entre ligandos. Este tipo de información es de relevancia directa para la investigación académica y farmacológica en las ciencias de la vida.

Por lo tanto, el desafío es lograr un gran crecimiento de cristales en una forma reproducible, ahorrar tiempo, forma de ahorro de mano de obra. Sería ideal si en el futuro, cristalógrafos de neutrones pueden, después de un adecuado trabajo de pre-caracterización, enviar sus soluciones a una plataforma automatizada o semiautomatizada que permitiría la exploración de una amplia gama de condiciones de una manera altamente sistemática y permitiría a los usuarios monitorear el crecimiento desde sus computadoras remotas.

Ashley Jordan en el Institut Laue-Langevin (ILL) en Grenoble, Francia, ha estado investigando dos nuevos métodos de crecimiento de cristales:el desarrollo de un módulo que podría permitir enfoques automatizados a mayor escala en el futuro (tarea 1), y un sistema de cristalización de flujo (tarea 2).

Tarea 1:un módulo para la exploración automatizada del crecimiento de grandes cristales

Este proyecto SINE2020 se ha centrado en el desarrollo de un módulo de pozos múltiples con control de temperatura en el que se puede optimizar el crecimiento de cristales. La idea de diseñar este módulo fue ampliar el enfoque para que se pudieran utilizar múltiples pozos de cristalización con control de temperatura individual (programable) para explorar una amplia gama de condiciones de crecimiento. Se fabricó un módulo prototipo que consistía en un diseño de placa personalizado que contiene 6 × 4 pozos donde pueden ocurrir los experimentos de cristalización individuales. Cada pozo se puede adaptar a diferentes condiciones, cada uno con control de temperatura independiente. Los pozos se calientan utilizando elementos calefactores Peltier con un sistema de retroalimentación de temperatura que permite que cada pozo se caliente y enfríe en un rango de temperatura de 4 grados C a 60 grados C, con una precisión de 0,1 grados. La configuración se diseñó para permitir el seguimiento y registro fotográfico del crecimiento de cristales.

Ashley Jordan, Ryo Mizuta y John Allibon (que desarrollaron el software) han construido y probado el sistema prototipo. Se han realizado ensayos de cristalización con tripsina y rubredoxina.

Después de SINE2020, la idea sería hacer estos módulos "plug and play" para poder utilizar un enfoque "robótico" más extendido. El usuario podría eliminar las ejecuciones de cristalogénesis una vez finalizadas y otras ejecuciones instaladas utilizando otro módulo (el módulo sería la unidad de trabajo de una matriz más grande), siendo todas visualizables con la cámara y proporcionando información de lapso de tiempo a un portal de usuario.

Tarea 2:cristalización de flujo

Otra forma de lograr un gran crecimiento de cristales es la idea de un sistema de cristalización por flujo. La idea es mantener condiciones de lote en estado estable alrededor de un cristal en todo momento durante su crecimiento, proporcionando un suministro constante de stock de proteína fresca al entorno de cristalización. Esto mantendrá las condiciones óptimas de la solución en todo momento y ayudará a minimizar la acumulación de impurezas en las superficies de los cristales; tales impurezas pueden dificultar el crecimiento de los cristales.

Se eligió una bomba Dolomite Mitos P para mantener el caudal extremadamente bajo (entre 70-1500 nl min-1) requerido para regular el sistema. Se diseñó y fabricó una cámara de cristalización adecuada que se puede conectar a la bomba utilizando una impresora 3-D. Esta cámara crea un entorno sellado y proporciona un fácil acceso a los cristales una vez que han crecido.