Por John Brennan
Actualizado el 24 de marzo de 2022
La electroforesis en gel sigue siendo el caballo de batalla de los laboratorios de biología molecular. Al aplicar un campo eléctrico, el ADN y las proteínas se separan (normalmente por tamaño) dentro de una matriz de gel. Aunque la técnica es común, la forma en que se interpretan los resultados varía según la aplicación posterior, ya sea una transferencia Western, una transferencia Northern, una transferencia Southern o una simple prueba de agarosa.
Cuando se trabaja con geles de agarosa, predominan dos tareas:1) distinguir los plásmidos sin cortar, mellados y lineales de su inserto, y 2) estimar los tamaños de los fragmentos utilizando una curva estándar confiable. Los siguientes pasos lo guiarán a través de ese proceso de una manera clara y reproducible.
Consulte su cuaderno de laboratorio para confirmar qué muestra se cargó en cada carril. Las etiquetas de carril que registró en el momento de la carga son su punto de partida para todos los cálculos posteriores.
La escalera contiene fragmentos de longitud conocida. Sus distancias de migración te servirán de referencia para dimensionar tus bandas desconocidas.
Usando una regla, mida la distancia desde el pozo hasta el tinte de seguimiento (el tinte que viaja más lejos). Registre este valor; las unidades son arbitrarias siempre que sean consistentes.
Mida la distancia de cada banda de escalera desde el pozo, luego divídala por la distancia del tinte de seguimiento. Esto produce la movilidad relativa (factor de movilidad) para cada estándar.
Ejemplo:si el tinte de seguimiento viajó 6 pulgadas y las bandas de escalera viajaron 5, 4,5 y 3,5 pulgadas, las movilidades relativas son 0,833, 0,75 y 0,583.
Ingrese las movilidades relativas y los tamaños de fragmentos correspondientes (en kilobases) en una hoja de cálculo. Los fabricantes suelen proporcionar estos tamaños en la hoja de datos de la escalera.
Cree un gráfico con movilidad relativa en el eje X y tamaño de fragmento en el eje Y.
Utilice la función Línea de tendencia para ajustar una ecuación de ley potencial (por ejemplo, y =ax^‑2). Apunte a un R² de al menos 0,90 para garantizar una curva confiable.
Los fragmentos más pequeños migran más lejos. Tenga en cuenta que los plásmidos superenrollados (sin cortar) viajan más lejos que los fragmentos lineales del mismo tamaño, mientras que los plásmidos mellados migran más lentamente.
Haga una referencia cruzada de las bandas de cada carril con la muestra que cargó. Para un plásmido digerido con dos enzimas, debería ver dos bandas distintas:una cerca de la parte superior (insertar) y otra cerca de la parte inferior (plásmido cortado). Una digestión con una sola enzima debería producir una sola banda que viaje un poco más lejos que el plásmido sin cortar, pero mucho menos que el inserto.
Mida la distancia desde el pozo hasta cada banda desconocida, divídala por la distancia del tinte de seguimiento y obtenga la movilidad relativa.
Inserte las movilidades relativas en la ecuación derivada en el Paso 7 para calcular el tamaño aproximado de cada fragmento.
Si observa bandas anchas y brillantes cerca del final de cada carril, es probable que tenga contaminación de ARN; revise sus pasos de purificación.
