Este protocolo describe un método básico para extraer ADN genómico de las hojas de maní utilizando un enfoque simple y rentable.
Materiales:
* Hojas de maní (frescas o congeladas)
* Nitrógeno líquido
* Mortero y mortero
* 1.5 ml de tubos de microcentrífuga
* Tris-HCL 100 mm (pH 8.0)
* 25 mm EDTA (pH 8.0)
* 1.4 m NaCl
* 10% de SDS (dodecil sulfato de sodio)
* Cloroformo:alcohol isoamílico (24:1)
* Isopropanol
* 70% de etanol
* RNase A SOLUCIÓN (10 mg/ml)
* Espectrofotómetro
Procedimiento:
1. Preparación de la muestra:
* Recoge hojas de cacahuete frescas o congeladas. Si usa hojas congeladas, descongele a temperatura ambiente.
* Pese aproximadamente 0.1-0.2 g de tejido de la hoja.
* Coloque las hojas en un mortero prefallado y las muele a un polvo fino con nitrógeno líquido.
2. lisis:
* Transfiera las hojas en polvo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
* Agregue 500 µl de tampón de lisis (Tris-HCl 100 mM, pH 8.0, EDTA 25 mM, pH 8.0, NaCl 1.4 M y SDS al 10%).
* Incubar el tubo a 65 ° C durante 30 minutos con un agitación suave ocasional. Este paso descompone las paredes celulares y las membranas, liberando el ADN.
3. Extracción de proteínas:
* Agregue 200 µl de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) al tubo.
* Agite el tubo vigorosamente durante 10 minutos.
* Centrifuge el tubo a 10,000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Este paso separa la solución en tres capas:capa acuosa (superior), interfase (media) y capa orgánica (abajo). El ADN está en la capa acuosa.
4. Precipitación de ADN:
* Transfiera cuidadosamente la capa acuosa a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1.5 ml.
* Agregue 0.5 volumen de isopropanol al tubo y mezcle suavemente. Esto precipitará el ADN de la solución.
* Incubar el tubo a -20 ° C durante 30 minutos.
* Centrifuge el tubo a 10,000 x g durante 10 minutos a 4 ° C. El pellet de ADN se formará en la parte inferior del tubo.
5. lavado y secado:
* Retire el sobrenadante y lave el sedimento de ADN con 500 µl de etanol al 70%.
* Centrifuge el tubo a 10,000 x g durante 5 minutos a 4 ° C.
* Retire el etanol y seca el aire durante 5-10 minutos.
6. Resuspensión y tratamiento con RNasa:
* Resuspender el sedimento de ADN en 50 µl de tampón TE (tris-HCl 10 mM, pH 8.0, EDTA 1 mM, pH 8.0).
* Agregue 1 µl de RNasa A SOLUCIÓN (10 mg/ml) al tubo.
* Incubar el tubo a 37 ° C durante 30 minutos para eliminar cualquier ARN restante.
7. Cuantificación de ADN y verificación de calidad:
* Cuantifique el ADN extraído usando un espectrofotómetro a longitudes de onda de 260 nm y 280 nm. La relación de absorbancia a 260 nm/280 nm debe estar entre 1.8 y 2.0, lo que indica ADN puro.
Notas:
* Este protocolo es una guía básica y es posible que deba adaptarse en función del material de la hoja específico y la calidad deseada del ADN.
* Siempre use guantes y capas de laboratorio al manejar muestras biológicas.
* Asegúrese de que todos los reactivos y equipos sean estériles para evitar la contaminación.
* También puede usar kits de extracción de ADN comerciales para un proceso más simplificado y eficiente.
Aplicaciones adicionales:
* El ADN genómico aislado se puede utilizar para varias aplicaciones de biología molecular, que incluyen:
* PCR (reacción en cadena de la polimerasa)
* Secuenciación de ADN
* Análisis genético
* Clonación
Este protocolo proporciona un método simple y rentable para aislar el ADN genómico de las hojas de maní, allanando el camino para diversas investigaciones y aplicaciones.
