Métodos para aislar aminoácidos libres de proteínas
1. Hidrólisis:
* Hidrólisis ácida: El método más común. Los ácidos fuertes (como HCl) se usan para romper los enlaces peptídicos en la proteína, liberando los aminoácidos individuales.
* Procedimiento:
* La muestra de proteína se trata con HCl concentrado (típicamente 6M) a altas temperaturas (100-110 ° C) durante 12-24 horas.
* Este proceso corta todos los lazos peptídicos, liberando aminoácidos libres.
* Después de la hidrólisis, el ácido se elimina por evaporación, dejando la mezcla de aminoácidos.
* ventajas: Efectivo, relativamente simple.
* Desventajas: Puede provocar degradación de aminoácidos, especialmente triptófano. Algunos aminoácidos como la cisteína pueden ser destruidos o modificados.
* Hidrólisis enzimática: Utiliza enzimas específicas (como proteasas) para descomponer las proteínas en péptidos y, en última instancia, los aminoácidos libres.
* Procedimiento:
* Las enzimas específicas se seleccionan en función de la estructura de la proteína y el resultado deseado.
* La incubación con la enzima en condiciones óptimas permite la descomposición controlada.
* ventajas: Las condiciones más suaves, menos degradación, pueden ser más selectivas.
* Desventajas: Puede ser más costoso, más lento que la hidrólisis ácida.
2. Separación y purificación:
* cromatografía:
* cromatografía de intercambio iónico: Separa los aminoácidos según su carga.
* cromatografía de exclusión de tamaño: Separa los aminoácidos según su tamaño.
* cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC): Método altamente sensible y preciso para separar y cuantificar los aminoácidos.
* electroforesis: Separa los aminoácidos en función de su carga y tamaño.
Consideraciones:
* Fuente de proteínas: El tipo de proteína con la que está comenzando influirá en el mejor método.
* Resultado deseado: ¿Está simplemente buscando identificar la presencia de aminoácidos libres o necesita cuantificarlos?
* Sensibilidad: El nivel de sensibilidad requerido en el análisis.
* Costo y equipo: Considere los recursos disponibles.
flujo de trabajo general:
1. Preparación de proteínas: Aislar y purificar la proteína de interés.
2. Hidrólisis: Elija el método de hidrólisis apropiado (ácido o enzimático).
3. Separación y purificación: Seleccione y optimice el método para separar y aislar los aminoácidos libres.
4. Identificación y cuantificación: Use técnicas como cromatografía, electroforesis u otros métodos analíticos para identificar y cuantificar los aminoácidos libres.
Nota importante: Los procedimientos y condiciones específicos para aislar aminoácidos libres de proteínas variarán según la fuente de proteínas, el resultado deseado y los recursos disponibles.
