1. Extraer ADN de la célula:
- Utilice un tampón de lisis celular o un kit de extracción de ADN para abrir la membrana celular y liberar su contenido.
- Separar el ADN de otros componentes celulares mediante métodos como la centrifugación o la precipitación.
2. Purifica el ADN:
- Eliminar impurezas como proteínas y ARN mediante tratamientos enzimáticos (p. ej., proteinasa K, RNasa A) o técnicas de purificación (p. ej., extracción con fenol-cloroformo, cromatografía en columna).
3. Digerir el ADN en fragmentos:
- Tratar el ADN con enzimas de restricción para cortarlo en fragmentos más pequeños y definidos.
- Elegir enzimas de restricción que reconozcan y escindan secuencias de ADN específicas.
4. Fraccionar por tamaño los fragmentos de ADN:
- Separar los fragmentos de ADN en función de su tamaño mediante técnicas como la electroforesis en gel o la cromatografía de exclusión por tamaño.
5. Ligar fragmentos de ADN a vectores:
- Combinar fragmentos de ADN con vectores de clonación o expresión que contengan secuencias esenciales para la replicación y expresión del ADN en organismos huéspedes.
- Ligar los fragmentos de ADN en los vectores utilizando ADN ligasa.
6. Transformar o transfectar los vectores recombinantes:
- Introducir los vectores recombinantes en células huésped (bacterias, levaduras, células animales) mediante técnicas como transformación (bacterias), transfección (células eucariotas) o electroporación.
7. Seleccione y clone células con los fragmentos de ADN deseados:
- Cultivar las células transformadas o transfectadas y seleccionar aquellas que hayan integrado con éxito los vectores recombinantes que contienen los fragmentos de ADN de interés.
- Clonar estas células para obtener poblaciones clonales que lleven los insertos de ADN deseados.
8. Ampliar y aislar poblaciones clonales:
- Hacer crecer las poblaciones clonales para ampliar el número de células que contienen los fragmentos de ADN.
- Aislar ADN de estas poblaciones clonales.
9. Verificar la presencia e integridad de los fragmentos de ADN:
- Analizar el ADN aislado mediante digestión con enzimas de restricción, electroforesis en gel o secuenciación para confirmar la presencia y la integridad estructural de los fragmentos de ADN.
10. Propagar y mantener las construcciones de ADN deseadas:
- Propagar y mantener las poblaciones clonales o construcciones de ADN que contengan los fragmentos de ADN deseados para su posterior análisis, investigación o aplicaciones biotecnológicas.
Si sigue estos pasos, podrá crear cromosomas con éxito a partir de fragmentos de ADN, lo que le permitirá estudiar, manipular o utilizar secuencias de ADN específicas de interés.
