Una nueva variación del sistema de edición de genes CRISPR-Cas9 facilita la reingeniería de cantidades masivas de células para aplicaciones terapéuticas. El enfoque, desarrollado en Gladstone Institutes y UC San Francisco (UCSF), permite a los científicos introducir secuencias de ADN especialmente largas en ubicaciones precisas en los genomas de las células con una eficiencia notablemente alta sin los sistemas de administración viral que se han utilizado tradicionalmente para transportar el ADN a las células.

"Uno de nuestros objetivos durante muchos años ha sido poner largas instrucciones de ADN en un sitio específico del genoma de una manera que no dependa de los vectores virales", dice Alex Marson, MD, Ph.D., director de Gladstone -Instituto de Inmunología Genómica de la UCSF y autor principal del nuevo estudio. "Este es un gran paso hacia la próxima generación de terapias celulares seguras y efectivas".

En el nuevo artículo publicado en la revista Nature Biotechnology , Marson y sus colegas no solo describen la tecnología, sino que también muestran cómo se puede usar para generar células CAR-T con el potencial de combatir el mieloma múltiple, un cáncer de la sangre, así como para reescribir secuencias de genes en las que las mutaciones pueden conducir a un sistema inmunitario heredado raro. enfermedades.

"Demostramos que podemos diseñar más de mil millones de células en una sola ejecución, lo que está muy por encima de la cantidad de células que necesitamos para tratar a un paciente individual", dice el primer autor Brian Shy, MD, Ph.D., miembro clínico. en el laboratorio de Marson.

Del ADN bicatenario al monocatenario

CRISPR-Cas9, un sistema que edita genes dentro de células vivas, se ha utilizado como herramienta de investigación básica durante la última década. Cada vez más, muchos científicos clínicos están entusiasmados con el potencial de CRISPR-Cas9 para generar terapias con células vivas.

Con la edición de genes, uno puede desactivar, eliminar o reemplazar un gen mutado que causa una enfermedad, o aumentar la actividad de lucha contra el cáncer de una célula inmunitaria, entre otras cosas. Si bien las primeras aplicaciones terapéuticas de CRISPR-Cas9 ingresaron recientemente a los ensayos clínicos, la tecnología todavía se ha visto limitada por el desafío de generar de manera segura grandes cantidades de células editadas correctamente.

Tradicionalmente, los investigadores han confiado en los vectores virales (las cubiertas de los virus sin sus componentes causantes de enfermedades) para llevar el ADN (llamado plantilla de ADN) utilizado para la terapia génica a las células. Sin embargo, la fabricación de grandes cantidades de vectores virales de grado clínico ha sido un cuello de botella importante para hacer llegar las terapias celulares a los pacientes. Además, los investigadores no pueden controlar fácilmente dónde insertan genes los vectores virales tradicionales dentro del genoma.

"El uso de vectores virales es costoso y requiere muchos recursos", dice Shy. "Un beneficio importante de un enfoque no viral de la ingeniería genética es que no estamos tan limitados por los costos, la complejidad de la fabricación y los desafíos de la cadena de suministro".

En 2015, el grupo de Marson, en colaboración con el laboratorio de la pionera de CRISPR, Jennifer Doudna, Ph.D., demostró por primera vez que podían insertar plantillas cortas de ADN en células inmunitarias sin vectores virales, utilizando un campo eléctrico que hace que las membranas externas de las células sean más permeables. . En 2018, desarrollaron un método para cortar y pegar secuencias de ADN más largas en células inmunitarias con CRISPR y lo publicaron en Nature. .

Luego, en 2019, los investigadores descubrieron que al usar también una versión modificada de las plantillas de ADN que pueden unirse a la enzima Cas9, la misma proteína que actúa como tijeras moleculares durante la edición de genes CRISPR, podrían entregar las nuevas secuencias al genoma objetivo. sitio de manera más eficiente. Ese trabajo fue publicado en Nature Biotechnology .

Sin embargo, se requirió más trabajo para mejorar el rendimiento de las células inmunitarias diseñadas con éxito y hacer que el proceso fuera compatible con la fabricación de futuras terapias celulares. Esos objetivos motivaron el estudio actual del equipo.

El ADN puede existir en cadenas simples o dobles (como piezas opuestas de velcro), y Cas9 se adhiere al ADN de doble cadena. Los investigadores descubrieron rápidamente que los altos niveles de plantilla de ADN de doble cadena pueden ser tóxicos para las células, por lo que el método solo podía usarse con cantidades bajas de plantilla de ADN, lo que generaba una baja eficiencia.

El equipo sabía que el ADN monocatenario era menos tóxico para las células, incluso en concentraciones relativamente altas. Entonces, en el nuevo artículo, describen un método para unir la enzima Cas9 modificada a una plantilla de ADN monocatenario, agregando solo un pequeño saliente de ADN bicatenario en los extremos.

"Esto nos brinda un enfoque equilibrado y lo mejor de ambos mundos", dice Marson.

La plantilla de ADN de cadena sencilla podría más que duplicar la eficiencia de la edición de genes en comparación con el enfoque anterior de cadena doble. Y los extremos de doble cadena de las moléculas permiten a los investigadores usar Cas9 para mejorar la entrega de vectores no virales a las células.

"Esta tecnología tiene el potencial de hacer que las nuevas terapias celulares y génicas sean más rápidas, mejores y menos costosas", dice Jonathan Esensten, MD, Ph.D., autor del nuevo trabajo y profesor asistente de medicina de laboratorio en la UCSF y un investigador afiliado en Gladstone.

Un camino a la clínica

En el estudio, los investigadores utilizaron la nueva plantilla de ADN para generar más de mil millones de células CAR-T que se dirigen al mieloma múltiple. Las células CAR-T son células T inmunitarias modificadas genéticamente para combatir eficazmente células o cánceres específicos. Con las nuevas plantillas dirigidas por Cas9 de cadena sencilla, aproximadamente la mitad de todas las células T obtuvieron el nuevo gen y, como resultado, se convirtieron en células CAR-T.

"Sabíamos que dirigir las plantillas de ADN a una ubicación específica en el genoma, llamada sitio TRAC, mejoraría la potencia antitumoral de las células CAR-T", dice Justin Eyquem, Ph.D., coautor del estudio. nuevo artículo, profesor asistente de medicina en la División de Hematología y Oncología de la UCSF e investigador afiliado en Gladstone. "Este nuevo enfoque no viral nos permite lograr ese objetivo mucho más eficiente, lo que acelerará el desarrollo de la próxima generación de terapias con células CAR-T".

Además, los investigadores demostraron que su enfoque podría, por primera vez, reemplazar en su totalidad dos genes asociados con enfermedades inmunitarias genéticas raras, los genes IL2RA y CTLA4.

En el pasado, los científicos habían demostrado que podían reemplazar pequeñas secciones del gen IL2RA donde determinados pacientes tenían mutaciones. Ahora, el equipo de Marson demostró que pueden reemplazar todos los genes IL2RA y CTLA4 a la vez, un enfoque de "talla única" que podría tratar a muchos pacientes con diferentes mutaciones en estos genes, en lugar de tener que generar plantillas personalizadas para la mutación de cada paciente. Casi el 90 por ciento de las células tratadas con este enfoque de ingeniería genética obtuvieron las versiones sanas de los genes.

Los investigadores ahora buscan la aprobación para avanzar en los ensayos clínicos utilizando la tecnología CRISPR no viral tanto en la terapia con células CAR-T como en el tratamiento de la deficiencia de IL2RA. + Explora más

El estudio fomenta un enfoque cauteloso de la terapéutica CRISPR