Materiales:
- Línea celular de interés de mamíferos (p. ej., HeLa, COS-7)
- Medio de cultivo celular (p. ej., medio Eagle modificado por Dulbecco, DMEM)
- Suero bovino fetal (SFB)
- Solución antibiótica penicilina-estreptomicina
- Materiales precursores de puntos cuánticos (por ejemplo, sales de seleniuro de cadmio (CdSe) o telururo de cadmio (CdTe))
- Borohidruro de sodio (NaBH4)
- ácido L-ascórbico
- Polietilenimina (PEI)
- Péptido de señal de localización nuclear (NLS)
- Reactivo de transfección (por ejemplo, Lipofectamine 2000)
Procedimiento:
1. Cultivo celular:
- Mantener la línea celular de mamífero de interés en un medio de cultivo celular suplementado con FBS y solución antibiótica de penicilina-estreptomicina.
- Coloque las células en cubreobjetos de vidrio o en placas de cultivo para microscopía y otros análisis.
2. Síntesis de precursores de puntos cuánticos:
- Preparar una solución madre del material precursor del punto cuántico (por ejemplo, sales de CdSe o CdTe) en un disolvente adecuado (por ejemplo, cloroformo o dimetilformamida).
- Para puntos cuánticos de CdSe, disuelva la sal de CdSe en trioctilfosfina (TOP) y agregue óxido de trioctilfosfina (TOPO) como agente estabilizante.
- Para puntos cuánticos de CdTe, disolver la sal de CdTe en TOP y añadir polvo de telurio y TOPO.
3. Conjugación de péptidos dirigidos al núcleo:
- Conjugar la solución precursora de puntos cuánticos con el péptido NLS para asegurar la localización nuclear.
- Mezclar el péptido NLS con la solución precursora de puntos cuánticos y agitar durante varias horas o toda la noche.
- Purificar la solución precursora de puntos cuánticos conjugada con NLS mediante centrifugación o filtración por membrana.
4. Síntesis de puntos cuánticos dentro de las células:
- Transfectar las células con la solución precursora de puntos cuánticos conjugada con NLS utilizando un reactivo de transfección adecuado (por ejemplo, Lipofectamine 2000).
- Siga las instrucciones del fabricante para el protocolo de transfección.
- Incubar las células durante un tiempo suficiente (por ejemplo, 24-48 horas) para permitir la síntesis de puntos cuánticos dentro del núcleo.
5. Reducción y Estabilización:
- Después de la incubación, trate las células con un agente reductor (por ejemplo, NaBH4) y un agente estabilizador (por ejemplo, ácido L-ascórbico) para reducir los precursores de puntos cuánticos y mejorar su estabilidad.
- Preparar una nueva solución de NaBH4 y ácido L-ascórbico en medio de cultivo celular.
- Añadir la solución del agente reductor y estabilizante a las células e incubar durante un breve periodo de tiempo (p. ej., 1-2 horas).
6. Imágenes y análisis:
- Utilice microscopía de fluorescencia para visualizar los puntos cuánticos que crecen dentro del núcleo de células vivas.
- La microscopía confocal o las técnicas de imágenes de superresolución pueden proporcionar información detallada sobre la localización y morfología de los puntos cuánticos.
- Analizar las propiedades ópticas de los puntos cuánticos, como los espectros de emisión, la intensidad y la fotoestabilidad, para evaluar su funcionalidad e idoneidad para aplicaciones específicas.
Consideraciones adicionales:
- La elección de los materiales precursores de los puntos cuánticos y las condiciones de síntesis pueden influir en el tamaño, la forma y la composición de los puntos cuánticos formados dentro de las células.
- Puede ser necesaria la optimización de las condiciones de transfección y síntesis para lograr una localización nuclear y una formación de puntos cuánticos eficientes.
- Deben incluirse controles apropiados, como células tratadas con precursores de puntos cuánticos no conjugados o células sin transfección, para garantizar una interpretación precisa de los resultados.
Siguiendo este protocolo, los investigadores pueden hacer crecer con éxito puntos cuánticos directamente dentro del núcleo de células vivas, lo que permite la exploración de nuevas vías en bioimagen a nanoescala, nanoingeniería celular y nanomedicina.
