La membrana que recubre una célula biológica no es simplemente una barrera; está repleto de proteínas involucradas en todo tipo de funciones biológicas críticas. Para comprender realmente qué hacen las proteínas de membrana y cómo, los investigadores necesitan saber cómo están organizadas y cómo interactúan entre sí. Pero descubrir esa información es un desafío.

Los investigadores de Yale han desarrollado un nuevo método de microscopía llamado Native-nanoBleach que supera los principales desafíos para comprender la organización de las proteínas de la membrana, incluida la dificultad para estudiar estas membranas sin alterar el entorno nativo y los límites a la resolución de los microscopios ópticos que normalmente se utilizan para estudiarlas.

Y para demostrar la eficacia del nuevo método, lo aplicaron con éxito a un enigma biológico (relativo a las proteínas implicadas en el desarrollo de los cánceres de páncreas y cómo podrían ser objeto de tratamiento) que ha permanecido sin resolver durante décadas.

Describen el nuevo método y sus ventajas en un nuevo estudio publicado en Nature Nanotechnology .

Los métodos típicamente utilizados en el estudio de la organización de las proteínas de membrana requieren eliminar el entorno nativo de la membrana que rodea a las proteínas y luego colocar proteínas aisladas de interés en entornos que imitan pero no replican completamente la complejidad de la membrana celular real, dijo Moitrayee Bhattacharyya, profesor asistente de farmacología. de la Facultad de Medicina de Yale y autor principal del estudio. Este enfoque, dijo Bhattacharyya, elimina un contexto importante ya que las proteínas interactúan con las moléculas que las rodean.

En segundo lugar, los microscopios ópticos, que se utilizan comúnmente para observar la organización de las proteínas, no tienen la resolución necesaria para determinar si las proteínas cercanas entre sí realmente interactúan o son simplemente vecinas en las membranas.

Por último, la cantidad de una proteína particular que se encuentra en la membrana celular puede ser demasiado baja o demasiado alta para los métodos de estudio actuales. En esos casos, los investigadores tienen que hacer ajustes; tienen que replicar proteínas que en su estado natural son muy pocas o separar proteínas de muestras donde hay demasiadas. Pero esto nuevamente puede eliminar un contexto importante sobre el estado natural de las proteínas mientras se asientan y funcionan en las membranas celulares.

"Lo ideal sería tener un método que funcionara con cualquier nivel endógeno de expresión de proteínas de la membrana celular", afirmó Bhattacharyya.

Para abordar el primer desafío, los investigadores utilizaron moléculas particulares, tipos de polímeros, para esencialmente eliminar complejos proteicos con la membrana celular circundante intacta. "Es como si la membrana celular fuera una lámina de masa para galletas y los polímeros fueran cortadores de galletas", dijo Bhattacharyya.

Estos trozos de proteína con la membrana celular circundante, denominados nanodiscos nativos, tienen aproximadamente 10 nanómetros de diámetro, lo suficientemente pequeños como para que cualquier proteína contenida en el nanodisco probablemente interactúe, lo que aborda el segundo desafío. Además, este enfoque funciona con cualquier proteína de la membrana celular en cualquier cantidad, lo que permite a los investigadores observar las proteínas en sus niveles naturales en las membranas nativas.

Una vez que se generan los nanodiscos, los investigadores pueden utilizar cualquier cantidad de técnicas comúnmente utilizadas para concentrarse en una proteína de interés particular. Luego cuantifican las proteínas en cada nanodisco con la ayuda de moléculas fluorescentes adheridas a ellos.

Es un enfoque que ofrece alta resolución espacial sin necesidad de hardware especializado, afirmó Bhattacharyya.

"Este trabajo presenta una nueva técnica para comprender cómo las proteínas de membrana, que representan alrededor del 60% de los objetivos de los fármacos, se ensamblan en unidades funcionales sobre o dentro de la bicapa lipídica nativa", dijo Gerard Walker, coautor del artículo y estudiante de posgrado. en el laboratorio de Bhattacharyya.

Para demostrar cómo se podría aplicar este método, los investigadores emprendieron un debate en biología que duró décadas. Una proteína llamada KRas está mutada en más del 90% de los cánceres de páncreas humanos, lo que genera un inmenso interés clínico y terapéutico. Si las subunidades de KRas se unen para formar dímeros (dos unidades) u oligómeros (más de dos unidades) en las membranas celulares ha seguido siendo el foco de una investigación de larga data.

Sin embargo, los estudios han producido hallazgos contradictorios. Los estudios en animales y celulares, que carecen de una resolución molecular detallada, muestran evidencia de que las unidades KRas se unen en las membranas celulares. Mientras tanto, los análisis biofísicos, que no retienen la membrana nativa alrededor de las proteínas, han encontrado restos de KRas en unidades individuales o monómeros.

"Con nuestro método, obtenemos lo mejor de ambos mundos", afirmó Bhattacharyya. "Conservamos el entorno de la membrana nativa y tenemos una resolución espacial y de una sola molécula muy alta. Cuando aplicamos nuestro método, descubrimos que KRas existe como dímeros y monómeros en cantidades similares. Pero cuando KRas muta, como en el cáncer de páncreas, los dímeros aumentan y los monómeros disminuyen."

El hallazgo resalta la importancia de la membrana celular nativa para comprender las proteínas de la membrana e identifica un objetivo (reducir la dimerización de KRas) para el tratamiento del cáncer. Esta es sólo una de las muchas formas en que se podría utilizar este método para comprender el papel de la organización de las proteínas de membrana en las enfermedades, afirmó Bhattacharyya.

"Es realmente gratificante ver que Native-nanoBleach ya se aplica con éxito a una amplia variedad de cuestiones biológicas apremiantes en el laboratorio de Bhattacharyya y más allá", dijo Caroline Brown, coprimera autora del estudio y Ph.D. candidato en el laboratorio del coautor Kallol Gupta, profesor asistente de biología celular.

Las proteínas de membrana constituyen un tercio de todas las proteínas del cuerpo humano y este enfoque puede utilizarse para estudiar cualquiera de ellas, afirmó Bhattacharyya.

"Es una técnica general", dijo. "Realmente no hay limitaciones."

En el futuro, Bhattacharyya y sus colegas esperan ampliar este enfoque para estudiar la organización de las proteínas en las membranas de varios orgánulos, estructuras como las mitocondrias, que se encuentran dentro de las células.

Más información: Gerard Walker et al, Organización oligomérica de proteínas de membrana de membranas nativas a nanoescala con resolución espacial y de una sola molécula, Nature Nanotechnology (2023). DOI:10.1038/s41565-023-01547-4

Información de la revista: Nanotecnología de la naturaleza

Proporcionado por la Universidad de Yale