La microscopía de fuerza atómica (AFM) ofrece un método para obtener imágenes sin etiquetas de la dinámica biomolecular a nanoescala para resolver cuestiones biológicas que no se pueden abordar a través de otros métodos de bioimagen, como la fluorescencia y la microscopía electrónica de barrido. Dado que tales métodos de imagen solo son posibles para sistemas biológicos extraídos de células o reconstruidos en sustratos sólidos, la nanodinámica dentro de las células vivas sigue siendo en gran medida inaccesible con los métodos de bioimagen existentes. En un nuevo informe publicado ahora en Science Advances , Marcos Penedo y un equipo de investigación en Nanolife Science y biotecnología de la Universidad de Kanazawa en Japón, superaron los límites de la bioimagen mediante el uso de nanoendoscopia-AFM. Durante el proceso, insertaron una sonda con forma de aguja en una célula viva para presentar fibra de actina, mapas tridimensionales (3D) y nanodinámica 2D del andamio interno de la membrana con cambios indetectables en la viabilidad celular. A diferencia de los métodos anteriores de AFM, la nanosonda accedió directamente a los componentes intracelulares objetivo y exploró las capacidades de AFM, incluidas las imágenes de alta resolución, el mapeo nanomecánico y el reconocimiento molecular para expandir el rango observable de estructuras intracelulares en células vivas.

Dinámica intracelular de bioimagen

La dinámica a escala molecular de los componentes intracelulares proporciona información sobre los mecanismos fundamentales de las funciones y enfermedades celulares. Sin embargo, los métodos de obtención de imágenes directas para tales nanodinámicas en células vivas son un desafío. Por ejemplo, mientras que la microscopía electrónica es útil para obtener imágenes de nanoestructuras de células congeladas en el vacío, son incapaces de obtener imágenes de la nanodinámica en células vivas en entornos fisiológicos, excepto como instantáneas estáticas de conformaciones fijas. De manera similar, mientras que la microscopía de fluorescencia a través del etiquetado de fluorescencia proporciona un método poderoso para visualizar la dinámica de las proteínas y los orgánulos en las células vivas, están limitadas por la incapacidad de generar imágenes de manera eficiente a nanoescala. Por lo tanto, existe una fuerte demanda de un método de formación de imágenes intracelulares sin etiquetas en entornos líquidos. La microscopía de fuerza atómica (AFM) es un candidato potencial para el papel con la capacidad de generar imágenes a escala subnanométrica para visualizar la nanodinámica de lípidos, proteínas y ADN sin etiquetas. Sin embargo, tales imágenes no son representativas de los sistemas biológicos como resultado de la extracción de una célula o la reconstrucción en un sustrato sólido in vitro. En este trabajo, por tanto, Penedo et al. propuso un método de imagen basado en AFM conocido como nanoendoscopia-AFM para observar la nanodinámica dentro de las células vivas sin etiquetarlas ni separarlas.

Experimentos de nanoendoscopia-AFM

Durante los experimentos, al igual que una cámara endoscópica, los investigadores insertaron una nanosonda con forma de aguja larga dentro de una célula viva para realizar imágenes AFM en 2D y 3D. El equipo mostró cómo la nanoendoscopia-AFM proporcionó una ventaja única para la obtención de imágenes de células vivas intracelulares sin etiquetas a nanoescala. El método proporciona un poderoso camino para observar fenómenos hasta ahora inexplorados en sistemas biológicos. Penedo et al. introdujo repetidamente la nanosonda dentro de la celda en diferentes posiciones del área deseada a través de mediciones de curva de fuerza versus distancia. Para obtener imágenes de toda la célula, la nanosonda tenía que ser lo suficientemente larga para penetrar completamente en la célula hasta alcanzar el sustrato, y con diámetros inferiores a 200 nm para minimizar el daño celular y facilitar la penetración de la membrana. El equipo usó una punta tetraédrica de silicio comercial como nanosonda, que molieron usando un haz de iones enfocado a las dimensiones preferidas. A continuación, el equipo utilizó las nanosondas dentro de diferentes áreas de una célula HeLa. Adquirieron una imagen de nanoendoscopia-AFM en 3D de una célula completa durante los experimentos e identificaron el núcleo de la célula HeLa del resto de la célula. Otras mediciones también indicaron las estructuras granulares internas. Para minimizar el daño celular durante la penetración, Penedo et al. redujo la fuerza de penetración y la longitud de la muesca tanto como fue posible. También realizaron experimentos de viabilidad celular para confirmar que la nanoendoscopia-AFM 3D no provocaba daños celulares graves al utilizar nanosondas con diámetros inferiores a 200 nm. Usando nanoendoscopia 3D-AFM, facilitaron la obtención de imágenes del citoesqueleto interno en células vivas para observar la organización 3D de las fibras sin soporte. El equipo también fusionó con éxito imágenes intracelulares resultantes de nanoendoscopia-AFM 3D y microscopia confocal.

Nanoendoscopia 2D-AFM

La capacidad de insertar una nanosonda larga en una célula muchas veces mientras se mantiene la viabilidad de la célula implicaba la posibilidad de ubicar el vértice de la sonda dentro de una célula viva para realizar mediciones AFM 2D/3D locales sin daños sustanciales. La nanosonda podría insertarse dentro de la célula para medir el lado citoplásmico de la membrana celular a través del modo de modulación de amplitud AFM. Las nanosondas tenían que ser lo suficientemente largas para penetrar completamente en la célula y llegar al fondo, y al mismo tiempo lo suficientemente delgadas para reducir el daño celular. Para lograr esto en la práctica, Penedo et al. desarrolló nanosondas hechas de carbono amorfo utilizando la deposición de un haz de electrones y midió la dependencia de la amplitud con la distancia para determinar la integridad de la célula. Realizaron experimentos de nanoendoscopia-AFM en 2D utilizando una célula de fibroblastos para ilustrar la estructura reticular de la membrana celular interna y observaron la arquitectura celular para estudiar la dinámica interna de las estructuras celulares. El trabajo destacó la posibilidad de utilizar nanoendoscopia-AFM 2D para estudiar la nanodinámica de estructuras internas en células vivas en entornos fisiológicos.

Perspectiva

De esta manera, Marcos Penedo y sus colegas mostraron las aplicaciones de la nanoendoscopia-AFM para medir las superficies internas citoplásmicas de las membranas celulares y los andamios asociados para comprender la disposición 3D de los filamentos de actina en su entorno intracelular natural en las células vivas. El equipo trató de minimizar el daño celular mediante el uso de nanosondas ultrafinas en forma de aguja en los experimentos. Los métodos AFM propuestos produjeron mapas 3D de estructuras celulares internas además de proyecciones 2D combinadas con métodos de fluorescencia existentes como la microscopía confocal o de superresolución. El método arrojará luz sobre la maquinaria celular en acción, in vivo, al tiempo que expone los motores moleculares fisiológicos. El método también abrirá nuevas posibilidades para estudiar la nanomecánica intracelular que juega un papel importante en las funciones celulares. El equipo puede utilizar el método para medir las características de rigidez, adhesión y disipación del núcleo para extraer información biológica adecuada para los campos interdisciplinarios de la biología celular y la medicina. + Explora más

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