Los microARN (miARN) son ARN reguladores cortos no codificantes que pueden reprimir la expresión génica postranscripcionalmente y, por lo tanto, se utilizan cada vez más como biomarcadores de enfermedades. La detección de miARN puede resultar ardua y costosa, ya que requieren amplificación, sondas de marcaje y radiactivas. En un informe reciente publicado en Avances de la ciencia , Arun Richard Chandrasekaran y colaboradores del Instituto y Departamento de Ciencias Biológicas de ARN, en la Universidad de Albany, Universidad Estatal de Nueva York, informó en un solo paso, ensayo de detección de microARN no enzimático utilizando nanointerruptores de ADN conformacionalmente que no responden.

Los científicos llamaron al ensayo 'miRacles, 'para abreviar' bucle condicional activado por micro-ARN de interruptores diseñados '. El ensayo demostró especificidad subatomol y de un solo nucleótido utilizando una lectura de electroforesis en gel de agarosa. En los experimentos, detectaron microARN celulares a partir de extracciones de ARN obtenidos de diferenciar músculos a escala de nanogramos. Los científicos presentaron una configuración experimental rentable para detectar miARN en un marco de tiempo de horas para proporcionar una alternativa convincente a los métodos existentes de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) y transferencia Northern para cuantificar los materiales genéticos reguladores.

Los miARN pueden regular muchos procesos biológicos durante el desarrollo fisiológico normal y la enfermedad al afectar la proliferación celular. diferenciación y apoptosis in vivo. La expresión de miARN se puede cuantificar en tejidos, células y fluidos corporales como biomarcadores estables para eventos celulares y diagnóstico de enfermedades, destacando la importancia de su detección. Sin embargo, La detección de miARN es un desafío debido a la baja abundancia, tamaño pequeño y similitudes en secuencia. Las biomoléculas comprenden aproximadamente el 0,01 por ciento del contenido total de ARN y las copias individuales de ARNm por rango celular pueden variar ampliamente. Adicionalmente, Los miARN de una familia pueden diferir en un solo nucleótido, mientras que los miARN específicos pueden regularse durante la enfermedad y la función celular regular. Como resultado, Las estrategias de detección de miARN requieren una alta especificidad y la capacidad de identificar correctamente algunas moléculas de una muestra abundante con moléculas de ARN predominantes.

Los métodos tradicionales para la detección de miARN incluyen transferencia Northern, reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (qRT-PCR), secuenciación de próxima generación e hibridación basada en microarrays para separar la señal de miARN del ruido. De los métodos especificados, La transferencia Northern puede identificar directamente miARN nativos, mientras que otros se basan en métodos de etiquetado adicionales o amplificación escalonada, agregando al costo, complejidad y rendimiento de la detección. Por ejemplo, Se pueden utilizar nanoestructuras de ADN innovadoras para la detección de miARN, donde varios grupos de investigación han combinado previamente nanoestructuras con nanopartículas, reacciones en cadena de hibridación y nanohojas de dicalcogenuro de metales de transición para permitir el proceso.

En el presente trabajo, Chandrasekaran y col. desarrolló un dispositivo basado en ADN relativamente simple para resolver un desafío biomédico complejo. En el ensayo de miRacles, Los científicos utilizaron un "reactivo inteligente" compuesto por nanointerruptores de ADN diseñados racionalmente para la detección de miARN nativo simple y rentable sin utilizar equipos especializados en el laboratorio. Los nanointerruptores de ADN se diseñaron originalmente como herramientas para experimentos biofísicos de una sola molécula y luego se reconocieron por su capacidad para detectar y cuantificar interacciones biomoleculares mediante electroforesis en gel. Los esfuerzos de investigación colaborativa anteriores del mismo equipo de investigación se centraron en la detección molecular para cuantificar los niveles de proteínas y detectar secuencias de ADN sintético como prueba de concepto.

El presente trabajo amplió los estudios y conceptos preliminares para producir detección y cuantificación de miARN multiplexados listos para el usuario. Los científicos analizaron nanogramos de extractos de ARN celular en un período de tiempo corto utilizando una configuración experimental construida con suministros de laboratorio comunes. Diseñaron el nanoconmutador de ADN como un dúplex lineal que formaba un bucle en presencia de la molécula de miARN objetivo. Para construir el nanointerruptor, Chandrasekaran y col. utilizó el enfoque de origami de ADN mediante la hibridación de oligonucleótidos cortos complementarios a un andamio de ADN monocatenario.

Diseñaron dos hebras "detectoras" distantes con voladizos complementarios a diferentes segmentos del miARN objetivo. Cuando el miARN se reconoce y se une a la construcción, el interruptor reconfigurado desde el estado lineal "apagado" al estado en bucle "encendido". Cuantificaron los dos estados usando electroforesis en gel de agarosa estándar para detectar la señal que surge del nanointerruptor en bucle. La señal solo fue amplificada por un solo miARN de interés, los resultados se compararon favorablemente con la técnica de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET).

Para validar el concepto, el equipo de investigadores eligió un miARN objetivo let-7b debido a su familia altamente conservada de más de una docena de miARN relacionados que variaban en uno o más nucleótidos. Estos miARN eran adecuados debido a su papel fundamental en las funciones biológicas y la desregulación en múltiples enfermedades humanas. Para eliminar la interferencia y el ruido entre el nanointerruptor y el objetivo, lo que provocó una reducción de la intensidad de la señal en comparación con una combinación perfecta, los científicos rediseñaron racionalmente los nanointerruptores. Para lograr una especificidad perfecta, desestabilizaron la interacción en el lado que contenía el desajuste. Los resultados del estudio ilustraron una alta especificidad del ensayo así desarrollado, proporcionando una respuesta a un desafío clave en la detección de miARN que culminó con una alta relación señal / ruido.

La baja abundancia de miARN también requirió una alta sensibilidad de detección, que los científicos lograron optimizando el protocolo. Luego realizaron experimentos similares para otras dos variantes de miARN (miR-15 ay miR-206), resultando en niveles de detección de subatomol a un solo attomole. Por ejemplo, para una concentración baja de una muestra objetivo (6 pM), la señal aumentó durante 4 horas, con pocos cambios más allá de ese plazo.

Los miARN también se estudian típicamente en cultivos celulares, muestras de tejido y fluidos corporales y procesadas fácilmente para recolectar ARN totales en la escala de microgramos, junto con una subfracción de ARN pequeño. Para esto, Chandrasekaran y col. usó células de mioblastos como un sistema modelo sustituto de diferenciación muscular, con miR-206 como objetivo principal. Durante el cultivo celular, identificaron miARN en la diferenciación de los músculos esqueléticos, donde la molécula miR-206 se regulaba significativamente durante la diferenciación tardía. Cuando los científicos recolectaron las células musculares indiferenciadas y diferenciadas para extraer pequeños ARN, confirmaron la diferenciación celular mediante transferencias Western y realizaron inmunocitoquímica para los marcadores de diferenciación temprana y tardía miogenina (Myog) y cadena pesada de miosina (MHC), respectivamente. Dado que los miARN individuales constituyen el nivel de partes por millón en masa del ARN total, detectar miARN es tan difícil como encontrar una aguja en un pajar. Para validar el ensayo para detección biológica, por lo tanto, Chandrasekaran y col. comenzó con la subfracción de ARN pequeña menos compleja. Al utilizar el nanointerruptor objetivo miR-206, los científicos observaron un aumento progresivo en la expresión de miR-206 en ARN pequeños entre muestras indiferenciadas y muestras diferenciadas durante 1-4 días.

Dado que múltiples ARNm también pueden alterar su expresión durante diferentes etapas celulares o de la enfermedad, el fenómeno requirió capacidades adicionales de detección. Para lograr esto en la configuración experimental, Chandrasekaran y col. utilizó la capacidad de programación de los nanointerruptores y desarrolló un sistema de multiplexación capaz de detectar múltiples miARN de la misma muestra. Colocaron las hebras del detector en las ubicaciones deseadas del andamio de ADN, dando como resultado bucles de diferentes tamaños cuando se unen al miARN objetivo. El tamaño del bucle del nanointerruptor determinó así la migración del gel, resultando en una banda única en el gel para una detección precisa. Para el experimento, los científicos eligieron cuatro miARN presentes en las células musculares; miR-206, miR-125b, miR-24 y miR-133-3p y un miARN de control negativo; miR-39 específico de la especie Caenorhabditis elegans.

Dentro de 50 ng de ARN pequeños, los científicos detectaron los cuatro miARN en varios niveles de expresión, mientras se confirma la no detección con el control negativo. La estrategia de multiplexación permitió a los científicos comparar directamente los niveles de miARN en una sola muestra, sin etiquetado ni amplificación. En total, el trabajo proporcionó un paso adicional en la dirección de expandir el rendimiento del ensayo miRacles. La capacidad también se puede ampliar para acomodar más miARN por conmutador.

De este modo, Chandrasekaran y col. avanzó sustancialmente desde su detección preliminar de prueba de concepto de secuencias de ADN sintético; para establecer, caracterizar y optimizar un ensayo de detección de miARN listo para usar con extractos biológicos. El trabajo demostrado fue un primer ejemplo del uso de nanointerruptores de ADN para detectar miARN a partir de una muestra biológica verdadera. Si bien el rendimiento del ensayo de miARN fue competitivo en comparación con otras técnicas de uso común, la selectividad de 1 nucleótido observada en el presente trabajo fue difícil de lograr con los métodos existentes. La sensibilidad de miRacles también superó la transferencia Northern y los microarrays. El ensayo podría medir miARN sin necesidad de amplificación, con protocolos más simples y sin el error añadido del procesamiento de muestras adicional. El protocolo simplemente mezcló los nanointerruptores con la muestra de líquido para electroforesis en gel, para producir resultados de alta calidad en el laboratorio. El trabajo de investigación es potencialmente transferible de muestras biológicas a clínicas para diagnosticar y monitorear enfermedades.

Más importante, el presente trabajo se alinea con el concepto más amplio de ciencia frugal; una visión prometedora de ciencia rentable que ya ha producido soluciones de bajo costo para técnicas de centrifugación de sangre y purificación de agua en ingeniería biomédica. Chandrasekaran y col. aspirar a seguir contribuyendo a la tendencia emergente de la ciencia, interrumpiendo la relación existente entre costo y rendimiento para proporcionar acceso a gran escala a métodos simples de detección de miARN con reactivos inteligentes de mezcla y lectura.

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