El mundo de la microscopía de barrido láser está evolucionando rápidamente gracias a la llegada de conjuntos de detectores rápidos y compactos. Estos conjuntos reemplazan el típico detector de un solo elemento de los microscopios de escaneo láser confocales tradicionales, lo que permite capacidades nuevas y únicas.
Mientras que los detectores convencionales solo proporcionan el valor de intensidad de la luz captada, un detector pixelado también permite registrar la distribución espacial de la luz incidente, creando efectivamente una pequeña imagen del área iluminada para cada punto de escaneo.
La información espacial adicional proporcionada por los conjuntos de detectores permite una técnica de superresolución conocida como microscopía de barrido de imágenes (ISM). ISM construye computacionalmente una única imagen a partir de un conjunto de datos multidimensionales sin procesar producidos por un microscopio. La imagen final se construye con una mejor relación señal-ruido (SNR), seccionamiento óptico y resolución espacial que la de un microscopio confocal tradicional.
En detalle, la resolución lateral de la imagen ISM puede superar el límite de Abbe hasta en un factor de dos. Estas ventajas, sin embargo, se logran explotando únicamente la información espacial; Las bioimágenes de fluorescencia modernas pueden enriquecerse aún más mediante la adquisición resuelta en el tiempo, lo que permite el acceso a información estructural y funcional codificada en la dinámica de la fluorescencia (por ejemplo, vida útil de la fluorescencia).
Recientemente, investigadores del Instituto Italiano de Tecnología (IIT) en Génova desarrollaron un microscopio ISM compacto y eficaz equipado con un detector de matriz de diodo de avalancha de fotón único (SPAD) capaz de proporcionar imágenes estructurales y funcionales de alta resolución en una sola arquitectura. La investigación se publica en Advanced Photonics .
El detector de matriz SPAD del que se informa consta de 25 diodos independientes dispuestos en una cuadrícula cuadrada. El tamaño pequeño y la lectura asíncrona permiten una detección rápida de fotones de fluorescencia incidentes. El esquema de adquisición de datos, basado en el método del dominio de frecuencia digital (DFD), es una técnica de muestreo heterodina que permite la construcción del histograma de decadencia de la fluorescencia con una resolución temporal de hasta 400 ps, adecuada para la mayoría de las aplicaciones de imágenes de fluorescencia.
La técnica es lo suficientemente simple como para permitir el cálculo del histograma en la misma placa de matriz de puertas programables en campo (FPGA) utilizada para controlar el microscopio y registrar la señal detectada, simplificando la arquitectura del microscopio.
Gracias a la información espacial y temporal única proporcionada por el detector de matriz SPAD, los autores demostraron la combinación de mediciones de vida útil de fluorescencia (FL) con ISM (FLISM). Además de los beneficios del ISM convencional, la SNR mejorada de las imágenes FLISM permite una estimación más sólida de la vida útil de la fluorescencia.
El informe destaca la versatilidad del microscopio al combinar ISM y mediciones resueltas en el tiempo con microscopía de agotamiento de emisiones estimuladas (STED), utilizando la técnica de separación por ajuste de por vida (SPLIT). El resultado es una imagen con resolución lateral mejorada y contraste obtenido sin modificar el esquema de adquisición. Además, las mediciones resueltas en el tiempo permiten obtener imágenes de múltiples especies con un solo detector para una mayor especificidad estructural.
El sistema puede distinguir diferentes tintes con sus valores de vida útil de fluorescencia, gracias a la representación fasorial de la dinámica de fluorescencia. Incluso utilizando tintes con valores de vida útil similares y espectros de excitación superpuestos, puede distinguir los diferentes fluoróforos utilizando la técnica de excitación entrelazada pulsada.
De hecho, al alternar pulsos de excitación de láser con diferentes colores, la información espectral se codifica efectivamente en la dimensión temporal. Gracias a la excelente resolución temporal del microscopio propuesto, la contribución de los dos tintes fluorescentes se puede separar posteriormente para evitar interferencias.
Según Giuseppe Vicidomini, investigador principal del laboratorio de Microscopía Molecular y Espectroscopía del IIT y autor correspondiente, "Los resultados de este trabajo sugieren que el futuro de la microscopía de barrido láser está estrechamente relacionado con los detectores de matriz SPAD, capaces de enriquecer el conjunto de datos de microscopía con datos adicionales. información espacial y temporal sin la necesidad de cambiar la arquitectura óptica de un microscopio confocal."
El trabajo demuestra que los detectores de matriz SPAD combinados con un sistema de adquisición personalizado hacen que el ISM con resolución de fotones sea fácilmente accesible y utilizable.
Más información: Giorgio Tortarolo et al, Microscopio de barrido de imágenes con resolución de fotones compacto y eficaz, Fotónica avanzada (2024). DOI:10.1117/1.AP.6.1.016003
Proporcionado por SPIE
