Por Pete Collins | Actualizado el 30 de agosto de 2022
La electroforesis separa macromoléculas como proteínas y ácidos nucleicos por tamaño, carga y otras propiedades fisicoquímicas. En las separaciones basadas en cargas, una solución tampón transmite el campo eléctrico y mantiene un pH estable, preservando la carga nativa y la estructura de los analitos. Esta estabilidad es fundamental para una resolución precisa.
La electroforesis aprovecha un campo eléctrico aplicado (o un gradiente químico en técnicas especializadas) para mover moléculas cargadas a través de una matriz de gel. Las moléculas migran hacia el electrodo de carga opuesta:las especies cargadas negativamente viajan al ánodo, las especies cargadas positivamente al cátodo. Debido a que las moléculas más grandes experimentan más fricción dentro del gel, se mueven más lentamente que las más pequeñas, lo que permite una separación basada en el tamaño. La distancia migrada se puede representar gráficamente en una escala logarítmica para estimar el peso molecular o la longitud del fragmento.
DGGE introduce un gradiente desnaturalizante (normalmente una mezcla de urea y formamida) dentro del gel. A medida que los fragmentos de ADN atraviesan el gradiente, las concentraciones crecientes de desnaturalizantes desestabilizan progresivamente la doble hélice. Cada fragmento deja de migrar una vez que la concentración de desnaturalizante local alcanza su punto de fusión. Esta técnica aprovecha el comportamiento de fusión dependiente de la secuencia para resolver fragmentos de ADN de longitud idéntica pero de secuencia diferente.
En la electroforesis basada en cargas, las especies iónicas del tampón conducen el campo eléctrico aplicado a través del gel, asegurando una distribución uniforme de la corriente. Al mismo tiempo, el débil par ácido-base del tampón mantiene el pH dentro de un margen estrecho. Debido a que el estado de carga y la estructura tridimensional de las proteínas y los ácidos nucleicos dependen del pH, un pH estable evita cambios conformacionales no deseados que podrían comprometer la fidelidad de la separación.
La elección del tampón adecuado depende del rango de pH deseado y de la necesidad de minimizar la fuerza iónica, que de otro modo podría generar calor excesivo y distorsión. Los buffers comúnmente utilizados incluyen:
Para un rendimiento óptimo, el pKa del buffer debe estar cerca del pH objetivo y la fuerza iónica general debe ser lo suficientemente baja como para limitar el calentamiento inducido por la corriente y al mismo tiempo permitir una transferencia de carga eficiente.
Al seleccionar y mantener cuidadosamente las condiciones del buffer, los investigadores pueden lograr separaciones reproducibles y de alta resolución, esenciales para los análisis posteriores.
