El autoensamblaje de colágeno en gotas que se evaporan genera redes alineadas de fibras de colágeno. Esquema de (A) procedimiento de fundición por gota y (B) vistas superior y lateral de una gota de colágeno que se evapora. Imágenes CRM de una gota de colágeno autoensamblada en el borde (C), (D) borde cercano, y (E) regiones intermedias de interés. Las imágenes están orientadas de manera que la parte superior de la imagen apunte hacia la línea de contacto de la gota. La ubicación de cada imagen se resalta en cuadros discontinuos en (B). Las barras de escala representan 50 micras. (F) Fracción de alineación y diámetro de fibra para geles de colágeno moldeados. (G) Imagen de CRM de una gota de colágeno autoensamblada. Se unen cinco imágenes CRM separadas para revelar la alineación radial de las fibras de colágeno. Barra de escala, 100 μm. (H) Fracción de alineación y diámetro de la fibra en función de la distancia desde la línea de contacto para geles de colágeno moldeados por gota. Se gelificaron soluciones de colágeno (pH 11) a HR controlada usando una solución saturada de MgCl2 (HR ~ 31%) sobre vidrio tratado con UVO. * P ≤ 0,05 y *** P ≤ 0,001. Crédito: Avances de la ciencia , doi:10.1126 / sciadv.aaz7748
Cuando una gota estacionaria que contiene un soluto en un solvente volátil se evapora, el flujo en la gota puede ensamblarse en patrones complejos. Los investigadores han examinado dicho transporte en la evaporación de gotitas sésiles en disolventes. En un nuevo informe ahora publicado en Avances de la ciencia , Bryan A. Nerger y un equipo de científicos en ingeniería química y biológica, y biología molecular en la Universidad de Princeton, NOSOTROS., demostrado flujo en la evaporación de gotas sésiles acuosas que contienen el polímero de autoensamblaje de colágeno de tipo I. El material se puede utilizar para diseñar redes hidratadas de fibras de colágeno alineadas. El equipo notó el efecto Marangoni (un término que se origina en la propagación de gotas de aceite en el agua) para dirigir el ensamblaje de fibras de colágeno a través de áreas de escala milimétrica en relación con la humedad ambiental y la forma geométrica de la gota. Nerger y col. incorporaron y cultivaron células de músculo esquelético en las gotitas que se evaporan para observar su orientación colectiva y la posterior diferenciación de los miotubos en respuesta a las redes alineadas de colágeno. El trabajo demuestra un simple, enfoque sintonizable y de alto rendimiento para diseñar hidrogeles fibrilares alineados para crear materiales biomiméticos cargados de células.
La miríada de patrones de deposición sólida que surgen del flujo de fluido impulsado por la evaporación fue informado por primera vez por Robert Brown en 1828 y posteriormente investigado para una variedad de aplicaciones actuales. incluida la microfabricación y la impresión por chorro de tinta. El anillo de café o flujo radial hacia afuera también puede ocurrir cuando el solvente es volátil, y se suprime el flujo de Marangoni impulsado por el calor latente de la evaporación. Los flujos de Marangoni que surgen de gradientes térmicos o impulsados por solutos en la tensión superficial también pueden generar flujos recirculantes. Los investigadores han descrito el flujo en las gotas que se evaporan principalmente en el contexto de partículas suspendidas en solventes que se evaporan por completo. En este trabajo, Nerger y col. mostró cómo el flujo en las gotas que se evaporan podría regular la tasa de autoensamblaje de proteínas y controlar la alineación de las redes de proteínas cargadas de células fibrosas. El equipo demostró que el flujo en la evaporación de las gotas acuosas de colágeno de tipo I neutralizado generaba redes de fibras de colágeno alineadas.
Los efectos de Marangoni térmicos e impulsados por solutos permitieron un flujo radial en la gota que se evaporaba para orientar las fibras de colágeno a través del autoensamblaje. Los científicos ajustaron la orientación de las fibras cambiando la tasa de autoensamblaje, humedad ambiental y geometría de la gota. Las células del músculo esquelético incorporadas en las gotas que se evaporan se orientaron y diferenciaron en miotubos multinucleados en respuesta a la alineación de las fibras de colágeno y solo una fracción del agua se evaporó de la gota, dando lugar a una construcción de hidrogel cargada de células. El hidrogel resultante tiene amplias aplicaciones para diseñar andamios biomiméticos para estudios en ingeniería de tejidos, biología del desarrollo y materiales de autoensamblaje.
Vídeos CRM de lapso de tiempo representativos de movimientos de cuentas en el borde, cerca y regiones medias de colágeno moldeado. La HR se controló usando una solución saturada de MgCl2 (HR ~ 31%) y las soluciones de colágeno se gelificaron sobre vidrio tratado con UVO. Crédito: Avances de la ciencia , doi:10.1126 / sciadv.aaz7748
Autoensamblaje de fibras de colágeno en gotas de colágeno que se evaporan
El equipo vertió soluciones neutralizadas de colágeno tipo I en placas de cultivo con fondo de vidrio tratadas con ozono / ultravioleta (UV) controlando la humedad relativa (RH) de las placas de cultivo antes de depositar colágeno dentro de la placa. Luego colocaron la placa de cultivo en una placa de Petri sellada más grande para iniciar el autoensamblaje de colágeno. Las construcciones de colágeno se autoensamblan mientras el agua se evapora de la gota, y el equipo visualizó la orientación de las fibras de colágeno en tres regiones distintas de la gota, incluido el borde, cerca del borde, y el medio. El equipo observó las orientaciones de las fibras de colágeno dentro de la gota y mostró su variación dentro de las gotas que se evaporan.
Nerger y col. incorporó perlas fluorescentes en las gotitas para comprender si la orientación de las fibras de colágeno se correlacionaba con los patrones internos de flujo durante la evaporación. Luego observaron el movimiento de las perlas y el autoensamblaje del colágeno para sugerir que el flujo de Marangoni impulsaba la recirculación dentro de las gotas que se evaporaban. Los movimientos de las perlas fueron consistentes con los patrones de alineación de las fibras de colágeno a lo largo de la gota. Los científicos cuantificaron el flujo calculando parámetros promediados en el tiempo y el conjunto, incluido el desplazamiento cuadrático medio (MSD), desplazamiento total, y velocidad de las trayectorias de las perlas. Las mediciones mostraron una mayor movilidad de las perlas en la región del borde cercano de la gota, mientras que la velocidad promedio de las perlas fue de cinco a diez veces mayor en el borde o en las regiones medias.
La evaporación impulsa distintos patrones regionales de flujo, que se atenúan por el autoensamblaje del colágeno. (A) MSD promediado en el tiempo y en conjunto para trayectorias de perlas. Se eliminaron trayectorias en la región media que superaban los 300 fotogramas de longitud para mejorar la eficiencia computacional. La pendiente, α, representa el exponente de la ley de potencias que se ajustó a los datos. (B) Velocidad media del cordón radial para 500 trayectorias del cordón identificadas en cada una de las tres réplicas. (C) Dirección del flujo radial correspondiente a un desplazamiento positivo o negativo. Desplazamiento radial del talón en el borde (D), (E) borde cercano, y (F) regiones medias de una gota de colágeno que se evapora. Las líneas negras representan la reflectancia media a 488 nm. Tiempos característicos asociados con la formación de fibras de colágeno que fluyen libremente, t1, y la formación de una red estable de fibras de colágeno, t2, están anotados en las parcelas (D a F). a.u., unidades arbitrarias. Trayectorias de un solo cordón codificadas por colores según el desplazamiento del cordón para el borde (G), (H) borde cercano, y (I) regiones medias de una gota de colágeno que se evapora. Se grafican las primeras 500 trayectorias que excedieron los 20 fotogramas de longitud en cada región de interés. (J) Campos de flujo observados en una gota que se evapora de colágeno que contiene perlas fluorescentes. Las soluciones de colágeno se gelificaron a HR controlada usando una solución saturada de MgCl2 (HR ~ 31%) sobre vidrio tratado con UVO. *** P ≤ 0,001. Crédito: Avances de la ciencia , doi:10.1126 / sciadv.aaz7748
Ajuste de la alineación y el diámetro de las fibras de colágeno
Nerger y col. Luego exploró la alineación de las fibras de colágeno en las gotitas donde la velocidad del flujo de Marangoni era proporcional a la tasa de evaporación. La alineación de las fibras de colágeno dependía de la velocidad de cizallamiento inducida por el flujo. Por lo tanto, el equipo planteó la hipótesis de que podrían sintonizar la alineación del colágeno ajustando la variación de RH (humedad relativa). El proceso les permitió también controlar la tasa de evaporación de las gotas. Probaron esto usando agua pura y soluciones de sal saturada en la placa de cultivo y usaron microscopía de reflexión confocal (CRM) para mostrar que la alineación de la fibra de colágeno disminuyó en las condiciones de alta humedad relativa proporcionadas por el agua o el cloruro de sodio (NaCl). Cuando disminuyeron la HR usando bromuro de litio (LiBr), la fracción de alineación disminuyó, mientras aumenta el diámetro del colágeno debido a la cinética reducida del autoensamblaje del colágeno. La RH regula la alineación de las fibras de colágeno regulando los caudales. Por lo tanto, velocidades de flujo suficientemente grandes podrían interrumpir la formación de una red de colágeno estable. El equipo también varió el pH de la solución y dedujo que la alineación de las fibras de colágeno es una función de la cinética del autoensamblaje en una gota que se evapora. Los científicos pudieron controlar el patrón de alineación del colágeno controlando la geometría de la gota.
La HR (humedad relativa) afecta la fracción de alineación y la geometría de las fibras de colágeno. Imágenes CRM representativas en la región del borde cercano de gotas de colágeno autoensambladas en presencia de (A) agua (RH ~ 100%) y soluciones saturadas de (B) NaCl (RH ~ 75%), (C) MgCl2 (HR ~ 31%), o (D) LiBr (RH ~ 6%). Barras de escala, 50 micras. (E) Fracción de alineación de fibras de colágeno en la región cercana al borde de las gotas de colágeno. (F) Velocidad media de la perla radial en la región cercana al borde de las gotas de colágeno. La velocidad se determinó a partir del promedio de 500 trayectorias de perlas. (G) Diámetro medio de la fibra de colágeno en la región cercana al borde de las gotas de colágeno. (H) Velocidad media de la perla radial en función del tiempo en la región cercana al borde de las gotas de colágeno. Los datos de velocidad de las perlas se suavizaron usando una media móvil de 10. Las líneas negras representan la reflectancia media a 488 nm. Desplazamiento de perlas en la región cercana al borde de las gotitas incubadas con soluciones saturadas de (I y J) MgCl2 o (K y L) LiBr. (I) y (K) representan trayectorias de cuentas al comienzo de un experimento y (J) y (L) representan trayectorias después del tiempo característico t2. El tiempo total durante el cual se trazan las trayectorias se anota encima de cada gráfico. Las soluciones de colágeno se gelificaron sobre vidrio tratado con UVO. * P ≤ 0,05 y *** P ≤ 0,001. Crédito: Avances de la ciencia , doi:10.1126 / sciadv.aaz7748
Modelado de la alineación celular para la diferenciación
Las redes alineadas de fibras de colágeno generalmente pueden influir en el comportamiento fisiológico de las células y los tejidos, así como en los procesos biológicos, como una vía prometedora en la ingeniería de tejidos. Para determinar si las células permanecieron viables en colágeno después de la evaporación de las gotas, Nerger y col. incluyó cáncer de mama humano o células del músculo esquelético en la solución de colágeno antes de la fundición y la evaporación. Las células de cáncer de mama se orientan radialmente a lo largo de las fibras de colágeno en la gota, y las células del músculo esquelético orientadas en la dirección de alineación de las fibras de colágeno. Después de cuatro días en cultivo celular, las células del músculo esquelético se diferenciaron para formar miotubos multinucleados alineados en la dirección de las fibras de colágeno a lo largo de la gota. Para confirmar la influencia del colágeno en la diferenciación, los científicos cultivaron células en un sustrato de vidrio en las mismas condiciones y observaron que las estructuras sarcoméricas eran contrastantemente más pequeñas y orientadas al azar. Los datos demostraron cómo la evaporación de las gotas de colágeno modelaba la alineación y la diferenciación celular en escalas de longitud milimétrica.
Vídeos CRM de lapso de tiempo representativos del autoensamblaje de fibra de colágeno en el borde, cerca del borde y regiones medias de colágeno moldeado. La HR se controló usando una solución saturada de MgCl2 (HR ~ 31%) y las soluciones de colágeno se gelificaron sobre vidrio tratado con UVO. Crédito: Avances de la ciencia , doi:10.1126 / sciadv.aaz7748
De este modo, Bryan A. Nerger y sus colegas utilizaron el flujo de Marangoni generado en la evaporación de gotas de colágeno tipo I para regular el autoensamblaje del colágeno y producir redes tridimensionales (3-D) con alineación de fibras sintonizables. diámetro y porosidad. Evitaron la evaporación completa de las gotas para formar redes de fibras de colágeno hidratadas en 3-D para apoyar el crecimiento y la diferenciación de las células de mamíferos. El sistema tiene potencial para generar una enfoque de alto rendimiento para incorporar explantes de tejido u organoides en redes alineadas de colágeno. El enfoque permitirá la producción de construcciones de tejido alineadas fisiológicamente relevantes para amplias aplicaciones en las ciencias de la vida y la medicina.
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