Sería imposible entender la vida sin tener una comprensión firme de las interacciones microscópicas entre moléculas que ocurren dentro y alrededor de las células. Los microscopios son y han sido una herramienta invaluable para los investigadores en este sentido, y existen muchos tipos diferentes de microscopios y técnicas de microscopía. Respectivamente, estas diferentes técnicas sirven para diferentes propósitos y tienen ventajas e inconvenientes.

En biología y medicina en particular, Los investigadores buscan técnicas de microscopía para obtener información tridimensional sobre la disposición y orientación de moléculas individuales dentro de las células a escala nanométrica. Un enfoque plausible para lograr esto es criogénico (es decir, a temperaturas extremadamente bajas) tomografía electrónica. Sin embargo, esta técnica no se puede utilizar para observar el interior de las células y se limita a cortes finos extraídos de la celda de muestra, lo cual no es tan útil como poder localizar directamente moléculas dentro de células intactas.

Para obtener medidas más útiles, La luz visible se puede utilizar para iluminar muestras especiales en lo que se conoce como microscopía de fluorescencia. Al usar este método, las moléculas objetivo están etiquetadas con "fluoróforos, "que son moléculas diminutas que absorben energía de la luz de un color específico (frecuencia) y luego la vuelven a emitir al brillar. Aunque se ha informado que este enfoque es útil para localizar fluoróforos individuales en el plano XY (una superficie plana), La localización tridimensional significativa de biomoléculas requiere más precisión en la dirección Z, o profundidad, de lo que es posible actualmente.

Es por eso que un equipo de investigadores de Tokyo Tech, incluido el Dr. Satoru Fujiyoshi, La Universidad de Nagoya y la Universidad de Kioto profundizaron en la microscopía de crio-fluorescencia para obtener información sobre las fuentes de error en tales mediciones y las formas de corregirlas. Las muestras que utilizaron fueron moléculas de ADN de longitud conocida (10 nanómetros) con diferentes fluoróforos en cada extremo.

Inicialmente, después de obtener imágenes de ambos fluoróforos y determinar la distancia entre ellos para ver si correspondía a la longitud de las moléculas de ADN, hubo un error significativo en sus mediciones. Esto fue causado por la orientación del fluoróforo en el espacio 3-D, que no siempre estaba perfectamente alineado con el plano de observación y, en cambio, estaba inclinado o inclinado. Esto se conoce como "efecto de orientación dipolar" y es un factor limitante importante en la microscopía de fluorescencia. El efecto está relacionado con la escasa precisión de medición en la dirección Z y, como demostraron los investigadores, puede corregirse.

Aquí es donde entra en juego la medición en condiciones criogénicas. Las moléculas se congelan instantáneamente en su lugar, permitiendo las mediciones 3D de alta precisión que contrarrestan el efecto de orientación del dipolo. La precisión (reproducibilidad) con la que se ubicaron los fluoróforos fue de ± 1 nanómetro en el plano de observación y ± 11 nanómetros en la dirección Z, o profundidad, lo cual no tiene precedentes para este tipo de microscopía. A través de estas correcciones, los investigadores lograron localizar los fluoróforos en las moléculas de ADN con precisión nanométrica (concordancia con el valor real). "Al corregir el efecto de orientación del dipolo, logramos mejorar la precisión de localización de estos fluoróforos hasta el nivel nanométrico, "comenta el Dr. Fujiyoshi.

El equipo de investigación continuará su trabajo en este enfoque utilizando un par de fluoróforos diseñados específicamente para condiciones criogénicas. con los que esperan obtener resultados aún mejores. “Este tipo de microscopía de crio-fluorescencia contribuirá a revelar los mecanismos y procesos dentro de las células a nivel molecular, "dice el Dr. Fujiyoshi.