Fueron más de 10 años en proceso, pero cuando se trataba de descubrir los secretos de la estructura molecular de las enzimas, la perseverancia dio sus frutos. Al estudiar y comparar las enzimas de dos hongos que degradan la celulosa, el caballo de batalla, Los investigadores del Laboratorio Nacional de Energía Renovable (NREL) del Departamento de Energía han identificado regiones en estas enzimas que pueden ser dirigidas a través de la ingeniería genética para ayudar a descomponer la celulosa más rápidamente.

Recientemente publicado en Comunicaciones de la naturaleza , "Actividad de celobiohidrolasa mejorada por ingeniería" describe el estudio de larga duración de NREL de las celobiohidrolasas fúngicas (CBH), enzimas que utilizan la hidrólisis como su principal química para degradar la celulosa. Trichoderma reesei (TrCel7A) y Penicillium funiculosum (PfCel7A). Años de investigación meticulosa han dado grandes recompensas:el equipo ha obtenido una mejor comprensión de las relaciones estructura-actividad de estas enzimas para predecir los mejores lugares para realizar cambios y mejoras.

Tanto en la naturaleza como en los procesos industriales, Las enzimas de esta familia se encuentran entre las enzimas más importantes para descomponer la celulosa. Un proyectado 2, La planta de etanol celulósico de 000 toneladas por día podría utilizar hasta 5, 000 toneladas de enzima al año, y la mitad de ese cóctel de enzimas podría ser de esta familia de enzimas. "En las últimas décadas ha habido un impulso para tratar de comprender y mejorar los biocatalizadores de esta familia de enzimas clave, "dijo Gregg Beckham, líder de grupo en NREL y autor principal del estudio. "Cuanto más eficiente sea la enzima, la menos enzima utilizada, y así el proceso es más económico. Sin embargo, todavía tenemos un largo camino por recorrer para poder realizar mejoras en la capacidad predictiva ".

Luego, en 2005, Los investigadores de NREL Mike Himmel, Steve Decker, y Bill Adney descubrió un CBH de un hongo diferente, PfCel7A, y descubrió que funciona un 60 por ciento mejor que TrCel7A. "Nos sorprendió que esta enzima fuera mucho mejor que el estándar de la industria, "dijo Decker, que lideró la tarea después de que Adney dejó NREL. "Realizamos muchos experimentos durante los últimos años para asegurarnos de que la actividad fuera real. Luego, por supuesto, queríamos saber por qué era mejor ".

"Si pudiéramos entender las diferencias estructurales, entonces podríamos usar esa información para diseñar mejores enzimas, lo que a su vez podría ayudar a reducir el costo de la producción de biocombustibles y bioquímicos celulósicos, ", dijo Beckham." Dado el desafío de trabajar con estas enzimas, Al equipo de NREL le tomó siete años de exhaustivo trabajo experimental desarrollar las herramientas necesarias para determinar que hay un par de puntos calientes en estos dos CBH que pueden modificarse para que funcionen mejor ".

Según Decker, "En el momento, Las herramientas para la ingeniería genética en Trichoderma eran muy limitadas, pero sabíamos por trabajos anteriores que otros huéspedes tenían problemas para expresar estas proteínas. Básicamente, comenzamos desde cero y construimos nuestro propio sistema interno de T. reesei de cepas hospedadoras, vectores, y protocolos de transformación y cribado. En comparación con sistemas bien desarrollados como E. coli, Poca eficiencia de transformación de T.reesei, tediosos procesos de selección, crecimiento lento, y el bajo rendimiento de proteínas hicieron de esta operación un desafío. Cada cepa que construimos tomó meses desde el diseño hasta la prueba final ".

El descubrimiento se desarrolló cuando NREL examinó de cerca las similitudes entre TrCel7A y PfCel7A y luego trabajó para aislar las diferencias. Ambas enzimas tienen una arquitectura de tres dominios:la molécula de unión de carbohidratos que la une a la celulosa; el dominio catalítico que descompone la celulosa; y el enlace que conecta estos dos dominios. Luego, el equipo de investigación llevó a cabo experimentos de intercambio de dominios mediante la creación de una biblioteca de quimeras, que es una colección de enzimas mutantes creadas a partir de las dos enzimas originales.

"Con tres dominios entre dos padres, que hace ocho combinaciones en total, ", dijo Beckham." Probamos las diversas combinaciones para averiguar qué área proporciona a la enzima un mejor rendimiento, y tal vez no sea sorprendente, en retrospectiva, es el dominio catalítico ".

Con esos hallazgos, Luego, los investigadores compararon los dominios catalíticos de TrCel7A y PfCel7A y encontraron ocho áreas que eran diferentes. Continuando reduciendo las posibilidades, el equipo tomó el padre TrCel7A e hizo modificaciones, uno a la vez, en esas ocho áreas y descubrieron dos modificaciones importantes que dieron como resultado que TrCel7A funcionara casi al nivel del padre PfCel7A.

"Esos dos, cambios muy pequeños en esta enorme proteína básicamente duplicaron el rendimiento de TrCel7A, ", dijo Beckham." Lo que esto les enseña a los investigadores que realizan ingeniería de proteínas en estas enzimas increíblemente desafiantes es que hay cambios muy pequeños en este dominio catalítico que pueden modificarse para afectar drásticamente el rendimiento de la enzima, haciéndola capaz de descomponer la celulosa más rápidamente y permitiendo así que los procesos industriales utilicen menos enzimas ".

"Sabíamos que el descubrimiento de PfCel7A era importante en ese momento, pero el camino a seguir no estaba del todo claro, "dijo Himmel, el líder general del proyecto. "Abordamos la familia de celulasas más difícil de mejorar primero, y así se deduce que las enzimas que degradan la biomasa de otras familias pueden volverse activas al máximo en un proceso más simplificado, con menos investigación y desarrollo. Fue la fusión de la bioquímica experimental y la ciencia computacional lo que llevó este estudio a Comunicaciones de la naturaleza y ese resultado solo fue posible con el financiamiento sostenido de la Oficina de Tecnologías de Bioenergía ".

El objetivo final del equipo de NREL es ayudar a otros investigadores a examinar la montaña de datos genómicos para encontrar mejores enzimas. basándose únicamente en su secuencia genética. "En 10 años, Sería tan emocionante poder sentarse con miles de secuencias de enzimas de esta familia y poder predecir cuáles probar, ", dijo Beckham." Este estudio es un paso en un camino muy largo, pero es un objetivo digno ".