Al trabajar con cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), una buena calibración es absolutamente esencial para garantizar resultados fiables y de calidad. La calibración adecuada de un instrumento de HPLC comienza con la elaboración de un estándar de calibración adecuado. En la mayoría de los casos, la calibración de hecho requiere una serie de estándares de concentración creciente para producir lo que se conoce como curva de calibración. Esta es una línea graficada y una ecuación asociada que describe la relación entre la concentración del químico que se está probando y la respuesta del detector de HPLC.
Determine el químico que desea probar usando HPLC (el " analito "). Por ejemplo, podría probar una serie de refrescos con contenido de fructosa, en cuyo caso la fructosa sería el analito.
Obtenga una cantidad del analito químico de pureza adecuada. Normalmente, la pureza debe estar por encima del 99% y el analito debe comprarse en una empresa de suministro de productos químicos acreditada. En el caso de la fructosa, por ejemplo, compraría fructosa pura de un vendedor de productos químicos y no de una tienda de comestibles.
Determine las concentraciones máximas y mínimas previstas del analito en las muestras que pretende probar en el laboratorio. HPLC. En el caso de los refrescos, examinaría las etiquetas de las bebidas y determinaría el contenido más bajo y más alto de fructosa entre las bebidas que probará. Tenga en cuenta que la muestra inicial (la bebida no alcohólica) puede diluirse o manipularse de otro modo durante la preparación para el análisis (dependiendo del método de HPLC utilizado) y así la concentración de analito en las muestras realmente inyectadas en la HPLC puede modificarse. Es la concentración de analito en las muestras como se ejecuta en la HPLC lo que debe tenerse en cuenta.
Determine el disolvente en el que va a disolver su analito para elaborar los estándares de calibración. Este disolvente debe ser capaz de disolver adecuadamente el analito en un rango de concentración relativamente amplio (al menos tan alto como en las muestras que pretende probar). Además, este solvente idealmente debería ser bastante similar a la "fase móvil": el solvente utilizado para transportar las muestras a través del instrumento HPLC.
Calcule la cantidad de analito requerida para hacer una solución estándar estándar. analito. Esto se encuentra multiplicando la concentración requerida del estándar estándar por el volumen deseado. La concentración del analito en esta solución debe ser al menos 10% mayor que la concentración de muestra más alta anticipada. Si la concentración de fructosa más alta anticipada en una muestra de refresco es de 8 gramos /100 mililitros, entonces el estándar de reserva podría prepararse a una concentración de 10 gramos de fructosa /100 mililitros. Un volumen razonable es de 500 mililitros, por lo tanto, se necesitarán 8/100 ml x 500 ml = 40 gramos de fructosa.
Pese la cantidad requerida de analito a un nivel adecuado de precisión. A menudo, es adecuado un valor de peso en gramos con una precisión de uno o dos decimales, pero puede ser necesaria una mayor precisión para algunos métodos.
Transfiera el analito pesado a un matraz volumétrico del volumen necesario y agregue el disolvente deseado a la marca de llenado en el matraz El uso de un matraz volumétrico (en lugar de un vaso graduado, por ejemplo) aumenta la precisión del valor de concentración estándar estándar. Asegúrese de que todo el analito se transfiere al matraz; use algo del solvente para lavarlo, si es necesario.
Tape el matraz volumétrico y agite o invierta suavemente hasta que el analito se disuelva por completo.
Realice una serie de diluciones variables del material estándar transfiriendo volúmenes conocidos del estándar de stock a matraces volumétricos, utilizando pipetas para una transferencia precisa, luego agregando solvente. La concentración estándar más baja debe estar por debajo de la muestra anticipada más baja que se analizará. En el ejemplo de refrescos, si la concentración de fructosa más baja esperada en una muestra es de 2 gramos /100 ml, entonces se podría hacer un estándar de 1 gramo /100 ml. Esto se haría mediante una dilución diez veces mayor del estándar estándar. La serie estándar debe incluir un total de 5 o 6 concentraciones, por lo que se requerirán diluciones adicionales para producir estándares de quizás 3, 5 y 8 gramos de fructosa /ml. Ahora tiene una serie de soluciones estándar para calibrar la HPLC.
Consejo
Es posible hacer estándares de calibración que contengan más de un analito si es necesario. A menudo es una buena práctica filtrar las muestras de calibración (y los estándares) antes de inyectarlos en la HPLC para eliminar las partículas finas que podrían taponar el instrumento.
Advertencia
Algunas normas se degradan rápidamente después de que son hecho. Asegúrese de que sus estándares se reemplacen con frecuencia si este es el caso. Al igual que con todos los procedimientos químicos, observe las precauciones adecuadas cuando trabaje con analitos o disolventes potencialmente nocivos, como los que son tóxicos o inflamables.
