Electroforesis en gel sigue siendo una técnica fundamental en biología molecular, que permite a los investigadores separar fragmentos de ADN por tamaño y cobrar por aplicaciones como huellas dactilares de ADN, mapeo de restricciones y secuenciación.
Como el ADN en sí es incoloro, los científicos añaden tintes de seguimiento (pigmentos azules o naranjas) a la muestra. Estos tintes migran junto con el ADN, proporcionando una referencia visual que permite al usuario medir el progreso y garantizar una identificación precisa de la banda.
En este método, una porción de gel de agarosa (un polisacárido derivado de algas) se prepara mezclando agarosa en polvo con un tampón que contiene agua y sal. La mezcla se calienta hasta que la agarosa se disuelve y luego se enfría para formar una matriz porosa. El gel se coloca en una cámara de electroforesis y se cubre con un tampón conductor.
Las muestras de ADN, combinadas con un tinte de carga, se cargan en los pocillos del extremo negativo (-) del gel. En el lado opuesto se coloca un electrodo positivo (+). La columna vertebral de fosfato del ADN, cargada negativamente, impulsa los fragmentos hacia el electrodo positivo cuando se aplica el campo eléctrico.
Los fragmentos más pequeños encuentran menos resistencia y viajan más rápido, produciendo bandas distintas que corresponden al tamaño del fragmento.
Los tintes de carga cumplen dos funciones principales:aumentan la densidad de la muestra para que se hunda en el pozo y proporcionan una señal visual que rastrea la migración del ADN. Los tintes comunes incluyen el azul de bromofenol (óptimo para fragmentos de alrededor de 400 pb) y xilenocianol (más adecuado para fragmentos de 2 a 8 kbp). El tinte se elige de modo que no reaccione ni altere el ADN. Los investigadores suelen utilizar 5 µl de tinte de carga por 1 µl de muestra de ADN, siguiendo las pautas de NEB y Thermo Fisher.
Se añade glicerol a la muestra para aumentar su densidad. Sin glicerol, la muestra líquida se esparciría por la superficie del gel en lugar de asentarse ordenadamente en el pozo, comprometiendo la formación de bandas claras y distintas.
Para la separación de proteínas, la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) reemplaza a la agarosa. El azul de bromofenol se incorpora de forma rutinaria al tampón de muestra; viaja al mismo ritmo que el borde de ataque de las bandas de proteínas, ofreciendo un indicador visual del progreso en tiempo real.
Después de la electroforesis, se utilizan colorantes que se unen al ADN, como el bromuro de etidio. se aplican. El bromuro de etidio se intercala entre las bases del ADN y emite una intensa fluorescencia bajo luz ultravioleta, lo que hace visibles las bandas. Debido a que es mutagénico, se requieren estrictas precauciones de seguridad al manipular y desechar el tinte.
