1. Fase estacionaria:
* Naturaleza de la fase estacionaria: Diferentes materiales como resinas de gel de sílice, alúmina, celulosa o de intercambio iónico exhiben polaridades y afinidades variables para diferentes compuestos. Esto dicta qué compuestos interactuarán con más fuerza y, por lo tanto, eluirán más tarde.
* Tamaño de partícula y porosidad: Las partículas más pequeñas y la mayor porosidad proporcionan una mayor superficie para la interacción con el analito, lo que mejora la eficiencia de separación.
* Actividad de la fase estacionaria: La actividad del gel de sílice se puede ajustar con un contenido de agua variable, lo que afecta la resistencia de la interacción con los compuestos polares.
2. Fase móvil:
* Naturaleza del solvente: La polaridad de la fase móvil influye en su poder eluyente. Un disolvente más polar eluirá compuestos polares más rápido, mientras que un disolvente menos polar retendrá los compuestos polares más tiempo.
* Fuerza de solvente: Los solventes más fuertes interactúan más fuertemente con el analito y los eluden más rápido. Esto se puede ajustar usando diferentes solventes o mezclándolos en diferentes proporciones (elución de gradiente).
* caudal: Un caudal más lento permite un mayor equilibrio entre las fases estacionarias y móviles, lo que resulta en una mejor separación. Sin embargo, las tasas de flujo excesivamente lentas pueden conducir a la ampliación de la banda.
3. Muestra:
* Tamaño de muestra: Los tamaños de muestra más grandes pueden sobrecargar la columna, lo que lleva a una separación deficiente.
* Composición de muestra: Las mezclas complejas pueden ser difíciles de separar, y ciertos componentes pueden interferir entre sí.
* Solubilidad de la muestra: La muestra debe ser soluble en la fase móvil para garantizar la elución adecuada.
4. Dimensiones de la columna:
* Longitud de la columna: Las columnas más largas proporcionan más área de superficie para la interacción, mejorando la separación.
* Diámetro de la columna: Una columna más estrecha aumenta la resolución, pero también limita el tamaño de la muestra.
5. Temperatura:
* La temperatura afecta la solubilidad del analito y la viscosidad de la fase móvil. Las temperaturas más altas generalmente conducen a una elución más rápida y, a veces, pueden mejorar la separación.
6. Otros factores:
* Presión: Aplicar la presión puede aumentar la velocidad de flujo, pero también puede afectar la eficiencia de separación.
* Tipo de columna: Los diferentes diseños de columnas, como columnas empaquetadas o columnas tubulares abiertas, pueden afectar la separación.
En general, la separación exitosa en la cromatografía de columna se basa en elegir la combinación correcta de fases estacionarias y móviles, optimizar las condiciones de funcionamiento y considerar las propiedades de la muestra.
