Usando Cas13 guiado por estructura, los investigadores de la Universidad de Rice y la Universidad de Connecticut modificaron una herramienta de edición de genes para que sirva como una prueba de diagnóstico altamente sensible para la presencia del virus SARS-CoV-2. Utilizaron un sensor electroquímico listo para usar para obtener resultados. Crédito:Jie Yang/Universidad Rice
Un método diseñado basado en CRISPR que encuentra ARN del SARS-CoV-2, el virus que causa el COVID-19, promete hacer que las pruebas para esa y otras enfermedades sean rápidas y fáciles.
Los colaboradores de la Universidad de Rice y la Universidad de Connecticut diseñaron aún más el sistema CRISPR-Cas13 de edición de ARN para aumentar su poder para detectar cantidades diminutas del virus SARS-CoV-2 en muestras biológicas sin el paso de amplificación y extracción de ARN que consume mucho tiempo necesario en prueba de PCR estándar de oro.
La nueva plataforma tuvo un gran éxito en comparación con la PCR, ya que encontró 10 de 11 positivos y ningún falso positivo para el virus en pruebas en muestras clínicas directamente de hisopos nasales. Los investigadores demostraron que su técnica encuentra signos de SARS-CoV-2 en átomomolares (10 -18 ) concentraciones.
El estudio dirigido por el ingeniero químico y biomolecular Xue Sherry Gao en la Escuela de Ingeniería George R. Brown de Rice y los investigadores postdoctorales Jie Yang de Rice y Yang Song de Connecticut aparece en Nature Chemical Biology .
Cas13, como su primo más conocido Cas9, es parte del sistema por el cual las bacterias se defienden naturalmente contra los fagos invasores. Desde su descubrimiento, los científicos han adaptado CRISPR-Cas9 para editar genomas de ADN vivo y se muestra muy prometedor para tratar e incluso curar enfermedades.
El investigador postdoctoral de la Universidad de Rice, Jie Yang, dirigió un esfuerzo para adaptar las herramientas de edición del genoma Cas13 para que sirvan como un detector altamente sensible de la presencia del virus SARS-CoV-2, que causa el COVID-19. Crédito:Jeff Fitlow/Universidad de Rice
Y se puede utilizar de otras maneras. Cas13 por sí solo se puede mejorar con ARN guía para encontrar y cortar secuencias de ARN objetivo, pero también para encontrar "colateral", en este caso, la presencia de virus como el SARS-CoV-2.
"La proteína Cas13 diseñada en este trabajo se puede adaptar fácilmente a otras plataformas previamente establecidas", dijo Gao. "La estabilidad y robustez de las variantes Cas13 diseñadas las hacen más adecuadas para el diagnóstico en el punto de atención en áreas de bajos recursos cuando no se dispone de costosas máquinas de PCR".
Yang dijo que el Cas13 de tipo salvaje, extraído de una bacteria, Leptotrichia wadei, no puede detectar un nivel attomolar de ARN viral en un período de 30 a 60 minutos, pero la versión mejorada creada en Rice hace el trabajo en aproximadamente media hora y detecta el SARS. -CoV-2 en concentraciones mucho más bajas que las pruebas anteriores.
Ella dijo que la clave es un bucle de horquilla flexible y bien escondido cerca del sitio activo de Cas13. "Está en el medio de la proteína cerca del sitio catalítico que determina la actividad de Cas13", dijo Yang. "Dado que Cas13 es grande y dinámico, fue un desafío encontrar un sitio para insertar otro dominio funcional".
Los investigadores fusionaron siete dominios de unión de ARN diferentes al bucle, y dos de los complejos fueron claramente superiores. Cuando encontraran sus objetivos, las proteínas emitirían fluorescencia, revelando la presencia del virus.
"Pudimos ver que el aumento de la actividad fue cinco o seis veces mayor que el Cas13 de tipo salvaje", dijo Yang. "Este número parece pequeño, pero es bastante asombroso con un solo paso de ingeniería de proteínas.
"But that was still not enough for detection, so we moved the whole assay from a fluorescence plate reader, which is quite large and not available in low-resource settings, to an electrochemical sensor, which has higher sensitivity and can be used for point-of-care diagnostics," she said.
With the off-the-shelf sensor, Yang said the engineered protein was five orders of magnitude more sensitive in detecting the virus compared to the wild-type protein.
The lab wants to adapt its technology to paper strips like those in home COVID-19 antibody tests, but with much higher sensitivity and accuracy. "We hope that will make testing more convenient and with lower cost for many targets," Gao said.
The researchers are also investigating improved detection of the Zika, dengue and Ebola viruses and predictive biomarkers for cardiovascular disease. Their work could lead to rapid diagnosis of the severity of COVID-19.
"Different viruses have different sequences," Yang said. "We can design guide RNA to target a specific sequence that we can then detect, which is the power of the CRISPR-Cas13 system."
But because the project began just as the pandemic took hold, SARS-CoV-2 was a natural focus. "The technology is quite amenable to all the targets," she said. "This makes it a very good option to detect all kinds of mutations or different coronaviruses."
"We are very excited about this work as a combinational effort of structure biology, protein engineering and biomedical device development," Gao added. "I greatly appreciate all the efforts from my lab members and collaborators."
Co-authors of the paper are Rice postdoctoral researcher Xiangyu Deng, undergraduate Jeffrey Vanegas and graduate student Zheng You; graduate students Yuxuan Zhang and Zhengyan Weng of the University of Connecticut; microbiology supervisor Lori Avery and Kevin Dieckhaus, a professor of medicine, of UConn Health; Yi Zhang, an assistant professor of biomedical engineering at the University of Connecticut; and Yang Gao, an assistant professor of biosciences at Rice. Compact CRISPR system enables portable COVID-19 testing
