Los científicos usan la citometría de flujo para diferenciar entre diferentes tipos de células u organismos microscópicos. Es una herramienta utilizada en muchas aplicaciones, como el diagnóstico médico o la patología forense. Si bien esta técnica experimental es bastante fácil de lograr, el análisis de los datos complejos producidos por el citómetro de flujo es más difícil debido a los múltiples factores experimentales y /o los parámetros del citómetro. Como tal, es rutinario que los datos citométricos se visualicen y analicen utilizando sofisticados programas profesionales como CELLQuest o FlowJo. La familiaridad con las técnicas de citometría de flujo, la maquinaria y el software es necesaria para comprender los resultados producidos por estos experimentos.
Comprensión de los datos de la citometría de flujo
Aclare el objetivo del experimento preguntando, "¿Qué era la pregunta o hipótesis que se investiga? " Esto será necesario para ajustar los resultados brutos a los formatos y configuraciones apropiados para un análisis posterior usando el software de citometría estadística. Realice los cambios necesarios para que los datos se muestren con la configuración pertinente (por ejemplo, celdas positivas, puertas negativas, intensidad de fluorescencia, poblaciones de celdas, etc.).
Buscar puertas. Las células pueden agruparse o simplemente observarse agrupadas en una gráfica de densidad o un diagrama de contorno. Los grupos a menudo se separan según su identidad. Si un grupo se tiñe muy intensamente para un marcador o anticuerpo en particular, se concluye que todos los miembros de ese grupo tienen la identidad del tipo celular específico, que expresa ese marcador. Es común encontrar células que son positivas para más de uno de estos marcadores, y estas células generalmente son intermedias y se denominan "doblemente positivas".
Mire los diagramas de dispersión. La forma en que los grupos de células se extienden en un diagrama de dispersión es una indicación del tamaño de las células. Las células con dispersiones muy grandes o altas son típicamente células grandes; sin embargo, pueden ser grandes simplemente porque contienen una alta proporción de citoplasma, o pueden ser altos porque tienen un núcleo muy grande. Dependiendo de la biología que se está investigando, esto variará ampliamente entre los experimentos.
Mire los números. Ajuste los gráficos para mostrar diferentes parámetros en un eje (generalmente el eje X) mientras mantiene los recuentos en el eje Y. Esto indica la proporción de la población de muestra que es positiva para ese parámetro en particular, ya que normalmente se observará un pico en una muestra teñida positivamente, que estará ausente de la muestra de control negativo.
Mire a múltiples- histogramas de parámetros. Ajustando el eje X y el eje Y para que cada uno represente un parámetro diferente que se investigó durante el experimento, es posible obtener una comprensión más profunda de las propiedades de la muestra. Por ejemplo, al establecer el eje X en fluorescencia roja y el eje Y en fluorescencia verde, se pueden calcular las compuertas cuadrangulares para que la muestra muestre cuatro regiones de un cuadrante en las que hay células y se tiñen en rojo o verde fluorescencia, ambos colores, o ninguno en absoluto. Esto permite que una muestra heterogénea se divida en sus partes componentes y cualquier entidad superpuesta para ser visualizada y cuantificada.
