El diseño genético de una célula está codificado dentro de su material genético, o ADN. Como el ADN nunca abandona el núcleo de la célula, para que esta información ingrese al citoplasma donde residen otras proteínas y componentes bioquímicos, primero es necesario transcribir el ADN en ARN mensajero (ARNm o ARN poli (A)). Este ARNm se convierte en proteínas que llevan a cabo muchas funciones de la célula. Para detectar o cuantificar mRNAs muy raros, hacer sondas para microarrays o construir bibliotecas de moléculas de DNA complementarias, el mRNA debe aislarse. Sin embargo, la extracción del ARN total (es decir, todo el ARN en una célula) y el subsiguiente aislamiento del ARNm no son procesos mutuamente excluyentes; el primero se debe realizar para extraer el ARNm.
Aislamiento del ARNm del ARN total
Homogeneización del TRIzol: el ARN total incluye todos los ARNm, ARN de transferencia, ARN ribosómico y otros ARN no codificantes . Para separarlos de otros componentes celulares, la célula se abre primero para liberar su contenido. Esto se hace resuspendiendo las células sedimentadas mediante centrifugación (centrifugado a altas velocidades) en TRIzol Reagent (Life Technologies). Otras versiones de TRIzol (como el reactivo TRI de Ambion) funcionan de manera similar.
Aislamiento total de ARN: se utiliza una serie de centrifugaciones para separar los diferentes componentes (proteínas, ADN, ARN) de la célula en capas o fases dentro de la suspensión La fase superior de color amarillo está compuesta de grasa y puede descartarse. La fase deseada se tiñe de rojo, contiene el ARN total y se retiene. Después de realizar una extracción con fenol-cloroformo y una serie de lavados con alcohol usando isopropanol y etanol, el ARN puede sedimentarse para el aislamiento del ARNm. Agregue inhibidores de RNasa para evitar que esta enzima degrade el ARN total.
Extracción de ARNm: es común usar un kit para aislar ARNm, ya que los protocolos de laboratorio caseros no generan grandes cantidades de ARNm altamente purificados. Los kits comerciales incluyen el FastTrack 2.0 de Invitrogen o el kit de aislamiento de mRNA Poly (A) Pure de Ambion. Estos pasos básicos son comunes a estos kits:
a) Mezcle el tampón de lisis inhibido por RNasa proporcionado en el kit con hasta 300 microlitros de ARN total.
b) Caliéntelo durante 5 minutos a 65 grados Celsius y luego enfríe la muestra en hielo durante un minuto.
c) Mezcle esto con cloruro de sodio 0.5M y luego disuelva completamente Oligo dT (ácido oligodesoxitimidílico) en esta muestra.
d) Centrifugue esta muestra y recupere el sobrenadante, que se lava varias veces en una serie de tampones de unión y bajos en sal que se incluyen en los kits.
e) Eluya el ARNm varias veces hasta obtener un volumen específico del kit (por ejemplo, 500 microlitros) se obtiene.
f) Precipitar el eluato por precipitación con acetato de sodio y etanol. Vuelva a suspender en hasta 20 microlitros de agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC).
g) Almacene a -80 grados Celsius y verifique la calidad y cantidad por espectrofotometría.
Consejo
Mantenga fríos todos los reactivos, células y ARN sumergiéndose en el hielo. Esto evita que el ARN sea degradado por otras enzimas que se liberan durante el proceso de homogeneización.
Advertencia
Los reactivos como TRIzol son tóxicos y no deben estar en contacto con la piel o las membranas mucosas. Respete siempre los protocolos de laboratorio seguros al manipular este reactivo.
