En la biosíntesis del hemo, el paso terminal es la inserción de hierro ferroso en la protoporfirina IX (PPIX) por la enzima ferroquelatasa. En condiciones fisiológicas, También se forman pequeñas cantidades de protoporfirina IX de zinc (ZnPP). Las concentraciones de ZnPP y PPIX en las células eritroides se alteran de forma característica por las condiciones que afectan la disponibilidad de hierro ferroso, aumentar las cantidades de PPIX, o disminuir la actividad enzimática de la ferroquelatasa. Desafortunadamente, el método de cuantificación estándar basado en HPLC requiere mucho tiempo y es complicado. Alternativas, también, han demostrado ser técnicamente demasiado exigentes o engorrosos para su adopción general. Para la medición de ZnPP solo, un fluorómetro portátil de cara frontal, el hematofluorómetro, está disponible comercialmente. Todavía, su uso está limitado por una alta fluorescencia de fondo de otros componentes de la sangre, lo que hace inevitable el lavado de muestras.
Un equipo de investigación dirigido por Georg Hennig de la Klinikum der Universität München (Alemania) desarrolló ahora un nuevo método para la cuantificación simultánea de ZnPP y PPIX en muestras de sangre sin lavar. Se basa en la excitación de longitud de onda dual para eliminar eficazmente la fluorescencia de fondo de otros componentes de la sangre. Los resultados obtenidos se correlacionaron estrechamente con las determinaciones mediante un ensayo de HPLC de referencia.
La clave del éxito fue la elección de las longitudes de onda de excitación adecuadas. Ambos deben sufrir una absorción prácticamente idéntica y su separación espectral debe ser pequeña, de modo que las profundidades de penetración de los fotones son esencialmente las mismas. La eficiencia de excitación de los fluoróforos responsables de la autofluorescencia debe diferir solo en una pequeña cantidad entre las dos longitudes de onda de excitación, de modo que la sustracción de los espectros de emisión elimina eficazmente la autofluorescencia. A diferencia de, el fluoróforo analito debe exhibir una gran diferencia en la eficiencia de excitación entre estas dos longitudes de onda de excitación, de modo que la diferencia entre los espectros de emisión es grande y no elimina la señal del fluoróforo del analito.
Este es el caso de 425 nm (el máximo de excitación de fluorescencia de ZnPP, emisión máxima a 593 nm) y 407 nm como longitud de onda correspondiente con absorción de hemo oxigenada idéntica, pero una eficiencia de excitación de ZnPP sustancialmente menor. Es más, a medida que la longitud de onda de excitación a 407 nm se acerca al máximo de excitación de PPIX a 397 nm, el espectro de emisión muestra un pico de emisión de fluorescencia PPIX pronunciado, que se encuentra a 627 nm. Como la eficiencia de excitación PPIX es mucho menor a 425 nm, el pico de emisión de fluorescencia de PPIX no se elimina en el espectro de diferencia y se puede evaluar junto con la señal de ZnPP.
El nuevo enfoque podría implementarse de manera simple y rentable en un dispositivo para su uso en condiciones de campo. Además, podría reducir la autofluorescencia en tejidos como la mucosa oral in vivo, permitiendo mediciones no invasivas de ZnPP y PPIX. (Texto aportado por K. Maedefessel-Herrmann)
