La microscopía STED revela la organización a nanoescala de las mallas TJ. un esquema que ilustra la TJ endógena en el contacto de célula a célula más apical en las células epiteliales. b Esquema que ilustra una malla tipo TJ formada en áreas superpuestas planas de células no polarizadas transfectadas con claudina. c, d Imagen confocal y STED representativa de un TJ endógeno formado marcado para Cldn3 (2nd-Atto647N) entre células epiteliales de tejido de duodeno de ratón (c) y una malla similar a TJ formada por YFP-Cldn3 sobreexpresado (α-GFP-NB- Atto647N) entre dos celdas COS-7 (d). e Serie temporal STED representativa de un solo color (1 fotograma/10 s) de una malla tipo TJ en una región superpuesta de células COS-7 vivas que expresan SNAP-Cldn3 (BG-JF646). Las flechas blancas indican la ruptura inicial del hilo seguida de la fusión de dos mallas más pequeñas en una malla más grande. Se aplicó un desenfoque gaussiano con un sigma de 20 nm. f Medición de ancho medio máximo (FWHM) de hebras TJ de SNAP-Cldn3 (BG-JF646) en células COS-7 fijas y vivas. Los datos representan la media ± SD. Cada punto de datos representa un perfil de línea de un total de 160 perfiles de línea de 8 mallas independientes tipo TJ (n = 160). El FWHM general resultó en 59 ± 11 nm para muestras fijas y en 69 ± 14 nm para muestras vivas. Todas las imágenes representativas derivan de 3 experimentos independientes. Barras de escala, 1 µm (c, d) y 200 nm (aumentos en c, d y e). Crédito:Comunicaciones de la naturaleza (2022). DOI:10.1038/s41467-022-32533-4
Sellan las células epiteliales y, bajo ciertas condiciones, permiten el paso de iones y agua:Las uniones estrechas forman una barrera paracelular en los tejidos y su disfunción se asocia con enfermedades. Aunque sus componentes moleculares se conocen desde la década de 1990, no está claro cómo se organizan las 26 proteínas llamadas claudinas.
Los científicos del Leibniz-Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie (FMP) ahora han obtenido conocimientos profundos sobre la estructura de las uniones estrechas, utilizando microscopía de agotamiento de emisión estimulada de superresolución (STED). Es la primera vez que se describe el mecanismo básico subyacente a todas las propiedades de barrera epitelial.
Las uniones estrechas (TJ) normalmente son excelentes para permitir el paso de iones o moléculas necesarias, mientras forman una barrera densa para evitar que las bacterias no deseadas y sus toxinas entren en el cuerpo. Estas barreras paracelulares, que pueden ser simultáneamente canales selectivos de iones y agua, se encuentran donde se encuentran las células epiteliales o las células endoteliales, es decir, donde diferentes tejidos están conectados entre sí o cuando la luz de un órgano necesita ser sellada del torrente sanguíneo.
La existencia de uniones estrechas se descubrió hace unos 60 años y sus principales componentes moleculares se conocen desde hace 30 años:26 proteínas de membrana llamadas claudinas. Dependiendo de la célula, las claudinas se organizan en varias constelaciones para formar redes semipermeables de hasta varios cientos de nanómetros de ancho. Por lo general, varias claudinas se unen, pero algunas barreras consisten en solo una o dos proteínas estructurales.
Pero la pregunta es, ¿cómo se organizan las claudinas para crear diferentes propiedades de barrera dependiendo de la célula o tejido en cuestión? y ¿hasta qué punto los claudin dependen unos de otros en el proceso? Hasta ahora, estas preguntas han permanecido sin respuesta porque era imposible ver a través de la estructura de los hilos, que tienen solo unos diez nanómetros de espesor. Ahora, los científicos de la FMP han logrado hacer exactamente eso usando microscopía STED.
"Este tipo de microscopía de superresolución y un excelente equipo de biólogos celulares, informáticos y fisiólogos nos han ayudado a arrojar luz sobre la arquitectura molecular de las uniones estrechas", dijo el Dr. Martin Lehmann, director del Cellular Imaging Group, último autor de el estudio. "Ahora hemos sido capaces por primera vez de describir el mecanismo que subyace a las principales propiedades de barrera epitelial".
Uso de STED para resolver mallas simples
Normalmente, la resolución de los microscopios de fluorescencia se limita a unos 250 nanómetros. Usando microscopía STED, son posibles 50 nanómetros o menos. Esto literalmente les dio a los investigadores una mayor comprensión.
"Con microscopía de fluorescencia estándar, nunca habríamos penetrado en la densa organización de la unión estrecha, pero STED nos ha permitido resolver las mallas individuales de la red. Como resultado, ahora podemos determinar la posición exacta de las proteínas, como así como para ver si las claudinas se entremezclan o separan, y cómo se segregan", afirma Hannes Gonschior, el primer autor del estudio, quien realizó su Ph.D. tesis sobre el tema en la FMP. "Esta organización a nanoescala era previamente desconocida".
Primero, los estudios se realizaron a nivel celular, y luego en tejido intestinal y renal de ratones. Impresionantes imágenes reprodujeron las proteínas marcadas con fluorescencia en diferentes colores, mostrando dónde se encuentran las proteínas y cómo se encadenan para formar una cremallera de colores.
Tres hallazgos del estudio, ahora publicados en Nature Communications , son de particular interés:
Creación de modelo para descubrimiento de fármacos
El hecho de que los investigadores de la FMP hayan podido determinar por primera vez la organización a nanoescala de las uniones estrechas es un gran éxito para la investigación básica. Pero la medicina también puede beneficiarse del avance. Esto se debe a que las mutaciones en las claudinas juegan un papel en una serie de enfermedades hereditarias, la más obvia es el síndrome HELIX, una condición rara que causa una reducción en la producción de sudor.
Una mutación en la claudina 10b es la culpable, que causa hipohidrosis y defectos de las glándulas lagrimales y salivales, así como una alteración de la regulación del calcio y el magnesio en el riñón. El equipo de investigadores también había experimentado con esta enfermedad mutante.
"Nuestra investigación aún está muy lejos de tener relevancia clínica", afirmó el biofísico Martin Lehmann al evaluar sus hallazgos. "Pero al menos ahora entendemos cómo se estructuran estas redes. Este es el primer paso, que nos permitirá buscar pequeñas moléculas que abran o cierren estas barreras".
El biólogo celular Hannes Gonschior agregó que "encontraron un modelo simplificado para el descubrimiento de fármacos y, de manera más general, realizaron investigaciones sobre el paso paracelular de iones. Es muy probable que nuestros hallazgos nos permitan comprender fenotipos y síntomas clínicos previamente inexplicados, con un defecto en una de estas barreras paracelulares particulares". Cerrar la brecha:un mecanismo de dos niveles para la barrera epitelial
