Figura 1. A) Se aislaron esplenocitos de bazos de ratón, y las células T y B se separaron usando clasificación de células activadas magnéticamente (MACS). Posteriormente, las células se sembraron en 384 pocillos y más de 10, Se seleccionaron 000 moléculas fluorescentes diferentes utilizando DOFLA. B) La imagen del microscopio de fluorescencia muestra que CDgB tiñe las células B pero no las células T. C) Gráfico de citometría de flujo de fluorescencia de CDgB frente a SSC entre poblaciones de células T y células B. Crédito:Instituto de Ciencias Básicas
La sangre humana contiene varios componentes diferentes, incluido el plasma, glóbulos rojos (glóbulos rojos), glóbulos blancos (WBC), y plaquetas. Entre estos, Los glóbulos blancos se dividen en numerosas subcategorías, cada una con funciones y características únicas, como los linfocitos, monocitos, neutrófilos y otros. Los linfocitos se subdividen a su vez en linfocitos T, Linfocitos B, y células NK. Distinguir y separar diferentes tipos de estas células es muy importante en la realización de estudios en el campo de la inmunología.
La discriminación de los diferentes tipos de células inmunitarias se realiza normalmente mediante citometría de flujo y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), que pueden identificar distintas poblaciones de células según su tamaño, granularidad, y fluorescencia. Si bien el tamaño y la granularidad por sí solos no pueden distinguir células con parámetros físicos similares, Los diferentes tipos de células inmunes muestran una combinación distinta de receptores inmunes en las superficies celulares. Por ejemplo, los linfocitos T y los linfocitos B expresan CD3 y CD19, respectivamente. Por lo tanto, Las células inmunitarias de identificación fluorescente se han basado en la tinción de las células utilizando múltiples anticuerpos contra diferentes receptores. Durante mucho tiempo se pensó que era imposible distinguir diferentes tipos de células inmunitarias sin utilizar estos anticuerpos.
Sin embargo, investigación novedosa y revolucionaria realizada por los científicos del Centro de Autoensamblaje y Complejidad dentro del Instituto de Ciencias Básicas, Corea del Sur, puede haber cambiado esto. Los investigadores emplearon un enfoque de biblioteca de fluorescencia orientada a la diversidad (DOFLA) para seleccionar más de 10, 000 moléculas fluorescentes diferentes utilizando los linfocitos B y T separados de los bazos de los ratones. De esto, lograron descubrir una nueva sonda fluorescente que puede discriminar los linfocitos B sobre los linfocitos T sin los anticuerpos dirigidos al receptor celular.
Figura 2. A) Estructura de la molécula CDgB. B) CDgB libre libre forma agregados en solución, que se disocia cuando se unen a las membranas lipídicas. Crédito:Instituto de Ciencias Básicas
Los investigadores llamaron a la nueva sonda CDgB, que significa Compuesto de designación verde para linfocitos B. CDgB es una molécula lipofílica que contiene un componente fluorescente unido a una cadena de hidrocarburo. Como CDgB contiene un grupo fluorescente polar y una cola de hidrocarburo, significa que las moléculas de colorante CDgB libres y no unidas forman agregados similares a las micelas en la solución y exhiben un bajo nivel de fluorescencia de fondo. Cuando se adhieren a las superficies de la celda, sin embargo, los agregados se disocian y provocan un pico en las señales de fluorescencia. Además, la naturaleza lipofílica del tinte significa que el tinte no se une a una proteína diana, y en su lugar se localiza directamente en la estructura de la membrana lipídica. Según los investigadores, este fue "el primer ejemplo en informar sobre este tipo de mecanismo de distinción celular".
Figura 3. A) Diferencia en la composición de lípidos de membrana entre células B y células T. B) CDgB tiñe selectivamente las membranas lipídicas de las células B que poseen una longitud de cadena de PC más corta y un porcentaje más bajo de colesterol. C) CDgB muestra mayor fluorescencia en células B inmaduras (CDgB ++) que en células B maduras (CDgB +) u otros linfocitos (CDgB-). Crédito:Instituto de Ciencias Básicas
El CDgB puede dirigirse selectivamente a las membranas celulares de los linfocitos B sobre los linfocitos T o las células NK. Los investigadores buscaron optimizar la selectividad de la CDgB probando diferentes derivados de las moléculas con varias longitudes de cadena de hidrocarburos de 4 a 20 carbonos. Se encontró que los derivados de CDgB con 14 a 18 carbonos mostraron la mayor selectividad hacia los linfocitos B, con C18 mostrando los mejores resultados. Se hizo más difícil distinguir las células a través de la fluorescencia cuando la longitud del carbono se incrementó más allá de 20. El hecho de que la longitud del carbono sea importante en la selectividad insinuó que el mecanismo dependía de la diferencia en las estructuras de la membrana entre los linfocitos B y T.
Los investigadores aclararon aún más este mecanismo mediante la realización de análisis lipidómicos de las membranas de las células B y T. La fosfatidilcolina (PC) comprende la mayor parte (> 60%) de los fosfolípidos de membrana de los linfocitos B y T. Se encontró que los linfocitos B en general tenían CP más cortos que los de los linfocitos T. Además, el contenido de colesterol de la membrana en los linfocitos T fue aproximadamente dos veces mayor que el de los linfocitos B. Estos factores dan a los linfocitos B una membrana celular más 'flexible', que se pensaba que era un factor crucial que explica por qué las moléculas de CDgB se adhieren más fácilmente a las membranas celulares de los linfocitos B que a las de los linfocitos T. Incluso entre los linfocitos B, se encontró que la fuerza de la fluorescencia era diferente según la madurez celular. Los progenitores de las células B y las células B inmaduras emitieron señales de fluorescencia mucho más brillantes que las células B maduras. lo que probablemente se deba a la mayor flexibilidad de la membrana en las células inmaduras.
Además, los investigadores concluyeron que este nuevo mecanismo de distinción de células vivas orientado a lípidos (LOLD) puede complementar el mecanismo de distinción de células existente para mejorar nuestra capacidad para distinguir tipos de células específicas de mezclas complicadas de diferentes células. Esta investigación fue publicada en el Revista de la Sociedad Química Estadounidense .
