Zoë Fisher y Katarina Koruza del laboratorio de soporte ESS Deuteration and Macromolecular Crystallization (DEMAX) y la Universidad de Lund han estado utilizando métodos de difusión de vapor para cultivar grandes cristales de proteínas para técnicas de neutrones como parte del paquete de trabajo Crystal Growth de SINE2020. Sin embargo, además de poder hacer crecer cristales lo suficientemente grandes para estas técnicas, también quieren hacerlos deuterados. Las versiones deuteradas permiten una mejor relación señal-ruido, fondo incoherente reducido y el uso de métodos de variación de contraste.

El equipo ha intentado producir grandes cristales de varias proteínas, incluida la proteína de membrana Tomato timidina quinasa (TOTK1) y la superóxido dismutasa (bSOD), que está presente en todos los organismos y está involucrada en el proceso de envejecimiento. Sin embargo, aunque lograron producir cristales agradables, simplemente no eran lo suficientemente grandes, menos de 0,1 mm3.

Pero Zoë y Katarina han tenido mucho más éxito con las proteínas de la anhidrasa carbónica humana (HCA). La proteína HCA IX en particular está implicada en la metástasis del cáncer y ha surgido como un posible objetivo para la detección del cáncer. imagen y tratamiento. Las técnicas de neutrones podrían proporcionar detalles sobre el sitio activo:enlaces de hidrógeno, organización del agua, Unión de ligandos:eso ayudaría con el diseño de mejores medicamentos contra el cáncer.

HCA II de tipo salvaje, HCA IX Mimic (donde parte de la molécula de HCA II se ha adaptado para imitar el sitio activo de la proteína HCA IX) y una variante de superficie (SV) de HCA IX, que tiene 6 mutaciones de superficie para hacerlo más soluble y estable, fueron las proteínas elegidas para el proyecto. Cuando no es eficiente producir proteínas deuteradas haciéndolas desde cero o comprándolas comercialmente, se deuteran mediante intercambio H-D donde se "empapa" en una solución deuterada (tampón). Para este trabajo todos fueron expresados ​​en E. coli bajo condiciones hidrogenadas y deuteradas para hacer versiones H y D.

Luego se dispusieron a cristalizar las proteínas utilizando métodos de difusión de vapor para que los cristales pudieran estudiarse mediante cristalografía de rayos X y neutrones.

Esto no fue tarea fácil. Las proteínas son muy sensibles. Fue necesario utilizar configuraciones que sean estables durante largos períodos de incubación y equilibrio. La temperatura, tasas de evaporación, El pH y las concentraciones de proteínas y precipitantes debían controlarse cuidadosamente mediante pozos de cristalización y control automático. por ejemplo, variando la temperatura hacia arriba y hacia abajo según sea necesario.

Adicionalmente, para hacer cristales lo suficientemente grandes para la cristalografía de neutrones, necesita utilizar un gran volumen de material de partida, típicamente 100-500 microlitros o cientos de mg. Estos grandes volúmenes significan que el crecimiento de los cristales es lento, por lo que es necesario controlar las condiciones durante muchos meses seguidos.

Desafortunadamente, los rendimientos cristalinos obtenidos para las versiones deuteradas no fueron tan buenos como para las versiones hidrogenadas, produciendo regularmente cristales cada vez más pequeños. Se descubrió que para algunas proteínas deuteradas no se podían utilizar las condiciones que funcionaban para las versiones hidrogenadas y las condiciones debían optimizarse aún más para hacer crecer cristales deuterados.

Pero con perseverancia Zoë y Katarina han logrado cultivar un cristal HCA (IX) SV de más de 1 mm3 y un cristal de 1,8 mm3 de imitación de HCA (IX). Ahora han podido obtener resultados de rayos X y también resultados de neutrones de LADI en ILL e iBIX en Japón.