Investigadores del Instituto de Química Física de la Academia de Ciencias de Polonia han demostrado, utilizando una técnica microscópica de superresolución, cómo seguir las reacciones químicas que tienen lugar en volúmenes muy pequeños. El método fue desarrollado en colaboración con PicoQuant GmbH, y permite observar reacciones dentro de orgánulos celulares individuales como los núcleos celulares.

Los mecanismos químicos responsables de las funciones vitales de la célula aún ocultan muchos secretos; solo recientemente los investigadores han tenido las herramientas para observar directamente los fenómenos químicos que ocurren en las células vivas. Sin embargo, debido a las continuas limitaciones técnicas, la ciencia carece de conocimientos básicos sobre los valores constantes de equilibrio de las reacciones químicas en las células. En otras palabras, los investigadores aún no saben qué cantidad de una sustancia química involucrada en una reacción celular dada se encuentra en una forma que ya ha reaccionado y cuánto está en una forma sin reaccionar. Estos desafíos se han superado en el estudio actual. La investigación colaborativa ha desarrollado y demostrado una modificación de la espectroscopia de correlación de fluorescencia de superresolución.

"Hemos estado lidiando con reacciones químicas en las células durante mucho tiempo. Por ejemplo, en 2013, determinamos los coeficientes de difusión de todas las proteínas en la bacteria Escherichia coli, gracias a lo cual fue posible determinar la tasa de reacciones que tienen lugar con su participación. Aquí estábamos interesados ​​en un problema similar en situaciones que involucran bajas concentraciones de reactivos, "dice el profesor Robert Holyst (IPC PAS)." Las reacciones biológicas son generalmente reversibles y, donde ocurren, Por lo general, se crea un cierto equilibrio dinámico entre la cantidad de sustancias reaccionadas y no reaccionadas. En nuestros intentos de determinar las constantes de equilibrio para diversas reacciones en las células, buscamos espectroscopía de correlación de fluorescencia de superresolución. Y aquí, nos encontramos con un interesante problema técnico cuya solución nos abrió nuevas posibilidades en el estudio de la química de la vida ".

Hay muchas variedades de microscopía, incluidos los que visualizan átomos individuales. Sin embargo, al observar las células, La microscopía óptica sigue siendo inmejorable debido a su baja invasividad y la capacidad de visualizar la estructura espacial de los organismos vivos. Por mucho tiempo, su desventaja básica era su resolución relativamente pobre:​​las limitaciones físicas fundamentales (difracción) hacen que sea imposible distinguir detalles menores de unos 200 nanómetros mediante técnicas ópticas estándar.

Un tipo de microscopía óptica es la microscopía de fluorescencia. Implica introducir un tinte fluorescente en los sitios de la muestra biológica que se está estudiando, y luego escanear la muestra con un rayo láser enfocado, que estimula las moléculas de tinte para que brillen. En 1994, Stefan W. Hell presentó un método para superar el límite de difracción en microscopía de fluorescencia mediante el agotamiento de la emisión estimulada (STED). STED requiere un rayo láser adicional que se asemeje a una rosquilla en sección transversal. Este rayo extingue las áreas externas del foco principal del rayo láser y consecuentemente reduce su tamaño a valores por debajo del límite de difracción. Con los métodos de superresolución, ahora es posible ver detalles espaciales de solo 10 nm con una resolución de tiempo de hasta microsegundos.

La espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) es una nueva rama de la microscopía óptica para estudiar el movimiento de moléculas. En variedades de superresolución, el foco del láser tiene un volumen medido en decenas de attolitros (un attolitro es una mil millonésima de mil millonésima parte de un litro). La medición implica medir la luz emitida por un tinte fluorescente adherido a la molécula probada excitada por un rayo láser. Conociendo el tamaño del foco y la duración de la fluorescencia, y con la ayuda de los modelos teóricos adecuados, es posible determinar la velocidad incluso de moléculas individuales.

"Durante algún tiempo, Se ha sabido que si bien la microscopía FCS de superresolución funciona bien cuando se observan moléculas que se mueven en dos dimensiones, p.ej. en las membranas lipídicas, falla en observaciones en volúmenes. Tiempos de difusión, determinado sobre la base de mediciones en 3-D, podría diferir de las predicciones de las mediciones en 2-D en un orden de magnitud o incluso más. Después de unos meses de investigación, Nos quedó claro que estas discrepancias se debían a la forma excesivamente simplificada de determinar el tamaño espacial del foco, "dice el Dr. Krzysztof Sozanski (IPC PAS).

Sobre la base de sus propios análisis teóricos y experiencias, los investigadores de Varsovia construyeron un nuevo Modelo teórico universal que introduce una corrección de la forma espacial del foco y tiene en cuenta su impacto en la relación señal / ruido medida. La corrección del modelo se verificó inicialmente en mediciones de la velocidad de difusión de varias sondas fluorescentes en soluciones.

"También llevamos a cabo experimentos más avanzados. Por ejemplo, Estudiamos una reacción reversible en la que las moléculas de colorante se adhieren a las micelas y luego se desprenden después de un tiempo. El sistema, compuesto por bolas relativamente grandes de moléculas de tensioactivo que reaccionan con las moléculas de tinte, condiciones reflejadas características de las estructuras biológicas, ", dice el estudiante de doctorado Xuzhu Zhang (IPC PAS). Las mediciones no fueron simples. Si las moléculas de ambos reactivos se movían lentamente, al pasar a través del foco, el tinte podría fusionarse / desconectarse repetidamente con / de las micelas y se promediaría la luz emitida.

Pero también podría haber una variante del otro extremo:las reacciones de conexión y desconexión podrían ser tan lentas que durante la transición a través del foco no habría ningún cambio en la relación entre los reactivos, entonces no habría promediado. "Nuestro modelo tiene en cuenta no solo los dos casos extremos, pero también todos los intermedios. Y con el conocimiento que tenemos a nuestra disposición sobre el tamaño real del foco, somos capaces de cambiar su tamaño y examinar experimentalmente todos los casos requeridos por el modelo tanto en el mismo sistema químico como en el mismo equipo, "enfatiza Zhang.

Una característica importante del método analítico desarrollado en el IPC PAS es el hecho de que no se necesitan cambios en los aparatos para su aplicación. Después de la adaptación adecuada, el método se puede utilizar para interpretar con mayor precisión los datos registrados por microscopios STED listos para FCS que ya están en producción.