1. Interrupción celular:
* Métodos mecánicos:
* homogeneización: Usando una licuadora o un homogeneizador de alta velocidad para romper físicamente las células abiertas.
* Sonicación: Uso de ondas de sonido para interrumpir las membranas celulares.
* Press French: Forzando las células a través de una pequeña abertura a alta presión.
* Grinding: Usando un mortero y una maja para romper físicamente las células.
* Métodos químicos:
* Detergentes: Interrumpir las membranas celulares disolviendo los lípidos.
* Enzimas: Use enzimas específicas como la lisozima para degradar las paredes celulares.
* Choque osmótico: Cambiar la presión osmótica de la solución para interrumpir las membranas celulares.
2. Centrifugación diferencial:
* Después de la interrupción celular, el lisado celular se gira a velocidades y duraciones crecientes. Esto separa los componentes en función de su tamaño y densidad.
* Centrifugación de baja velocidad: Pastura de componentes más grandes como los núcleos y los restos celulares.
* Centrifugación de velocidad media: Mitocondrias y lisosomas de pellets.
* Centrifugación de alta velocidad: Microsomas y ribosomas de pellets.
* Ultracentrifugación: Componentes más pequeños de pellets como proteínas y ácidos nucleicos.
3. Centrifugación de gradiente de densidad:
* Este método refina aún más la separación lograda por centrifugación diferencial. Se crea un gradiente de sacarosa u otras sustancias en un tubo, y el lisado celular se coloca en la parte superior. Durante la centrifugación, los componentes se mueven a través del gradiente hasta que alcanzan una densidad igual a la suya.
* Tipos:
* gradiente de sacarosa: Comúnmente utilizado para separar los orgánulos.
* Gradiente de cloruro de cesio: Excelente para aislar ADN y ARN.
4. Cromatografía de afinidad:
* Este método explota la unión específica de una molécula objetivo a un ligando inmovilizado en una columna.
* ligando: Una molécula que se une específicamente a la molécula objetivo.
* columna: Una matriz sólida con el ligando inmovilizado.
* Elución: Después de la unión, la molécula objetivo se eluye de la columna utilizando una solución específica.
5. Electroforesis:
* Se utiliza para separar proteínas basadas en el tamaño y la carga, y los ácidos nucleicos basados en el tamaño.
* SDS-PAGE: Separa las proteínas basadas en el tamaño.
* electroforesis en gel de agarosa: Separa los ácidos nucleicos basados en el tamaño.
6. Inmunoprecipitación:
* Este método utiliza anticuerpos para aislar proteínas específicas.
* Anticuerpos: Unirse a una proteína específica de interés.
* Precipitación: Después de la unión, el complejo proteína-anticuerpo se precipita fuera de solución.
7. Citometría de flujo:
* Este método utiliza láseres y sondas fluorescentes para analizar y clasificar las células o componentes celulares en función de sus características físicas y biológicas.
Ejemplo:aislar mitocondrias
* Las células se interrumpen usando homogeneización o una prensa francesa.
* El lisado celular se centrifugó a una velocidad media a las mitocondrias de pellets.
* El sedimento se resuspende y se purifica aún más utilizando la centrifugación de gradiente de densidad.
La elección del método depende del tipo de célula específico, el orgánulo o la molécula de interés y el nivel de pureza deseado. Cada técnica tiene sus fortalezas y debilidades, y los investigadores a menudo usan una combinación de métodos para obtener los resultados deseados.
