El método CRISPR mejorado ofrece grandes oportunidades para la modificación selectiva de genes en plantas superiores, tanto para el mejoramiento como para la investigación. El estudio, dirigido por el Prof. Alain Tissier y el Dr. Tom Schreiber, ha sido publicado en Molecular Plant. .

CRISPR/Cas es un método con un enorme potencial para la modificación selectiva de genes individuales. Sin embargo, esto no se aplica a todo tipo de modificaciones genéticas que los criadores y científicos tienen en sus listas de deseos. Si bien las tijeras genéticas son ideales para eliminar genes, es decir, apagar o eliminar genes existentes, no funcionan bien para insertar genes con precisión o reemplazar segmentos de genes. Hasta la fecha, las tijeras genéticas han resultado demasiado ineficaces y, por lo tanto, de poca utilidad para la inserción selectiva de genes en el ADN de las plantas superiores.

"La razón de esto es el mecanismo de reparación interno de la planta para las roturas del ADN", afirma Schreiber. Estas enzimas reparadoras están presentes inmediatamente tan pronto como se produce un daño en el ADN. También reconocen los cortes suaves realizados por las tijeras genéticas y al instante vuelven a unir las dos hebras de ADN cortadas de la doble hélice. Este pegado del ADN cortado se produce muy rápidamente y de forma poco precisa; hay pérdidas menores de información en las que se pierden o agregan pequeñas secciones de ADN.

"Estas imprecisiones no suponen un problema en los proyectos knock-out y son incluso deseables", afirma Schreiber, "porque de todos modos quiero desactivar el gen. Pero si quiero insertar un gen, hay que hacerlo con mucha precisión". La información genética debe insertarse exactamente, no puede faltar ni un solo componente y no puede integrarse ningún componente adicional; de lo contrario, el gen pierde su función y todo el experimento será en vano."

Por esta razón, la inserción precisa y sin cicatrices mediada por CRISPR/Cas de genes más grandes o segmentos de ADN hasta la fecha sólo ha tenido éxito en casos individuales raros. Para aumentar la tasa de éxito de la inserción genética, los científicos de Halle equiparon las tijeras genéticas con una enzima adicional, la llamada exonucleasa.

Las exonucleasas pueden alterar los sitios de escisión del ADN creados por las tijeras genéticas de tal manera que las enzimas reparadoras internas de la célula ya no pueden reconocer ni reparar el daño del ADN. Por tanto, el segmento de ADN que se insertará mediante CRISPR/Cas tendría tiempo suficiente para integrarse en la posición correcta mediante otro mecanismo de reparación celular muy preciso.

En el experimento, los científicos de Halle probaron varias exonucleasas de origen viral, bacteriano, vegetal y humano para determinar su capacidad para aumentar el número de eventos precisos de inserción de genes. Introdujeron las tijeras genéticas con las exonucleasas correspondientes y un segmento del gen X en las células de las hojas de la planta del tabaco Nicotiana benthamiana.

Estas células de tabaco habían sido equipadas previamente con un gen para un marcador fluorescente verde. También contenían un gen X destruido, necesario para la formación del tinte verde fluorescente. Sin embargo, el marcador fluorescente no se puede generar mientras falte una gran parte de la información genética del gen X.

El marcador verde solo se puede producir cuando la sección del gen faltante de X se reinserta con precisión usando CRISPR/Cas, reparando así el gen X. Cada célula con una inserción genética exitosa emitirá fluorescencia en verde y los investigadores podrán simplemente contar la tasa de eventos de inserción genética exitosa. .

Dos de las exonucleasas probadas, incluida una de la familia de los virus del herpes, demostraron ser especialmente eficaces. Utilizándolos, el equipo de Halle logró 38 veces más eventos de inserción genética perfecta que con CRISPR/Cas solo.

Este enfoque experimental se probó luego con otros genes que se incorporarían y en otras plantas, a saber, berro (Arabidopsis thaliana) y trigo. Dado que la inserción del gen en las plantas de tabaco tuvo lugar sólo localmente en las hojas, el gen integrado se perdió en la siguiente generación hija y, por lo tanto, sólo estuvo presente en el genoma durante un tiempo limitado.

Por eso, en Arabidopsis y en el trigo, los expertos de Halle CRISPR intentaron incorporar el gen en las células de la línea germinal para garantizar una herencia estable para las futuras generaciones de plantas. Con la ayuda de las exonucleasas probadas, la activación de genes estables, es decir, heredables, resultó exitosa en Arabidopsis con una frecuencia diez veces mayor y en trigo en más del 1% de las plantas hijas.

"Un 1 por ciento no parece mucho al principio", explica Schreiber, "pero si un obtentor quiere introducir un determinado rasgo en su planta, sólo tendría que examinar entre 50 y 100 plantas hijas de primera generación utilizando nuestro CRISPR optimizado. /Método Cas para encontrar una planta con el rasgo deseado. Esto ahorraría una cantidad considerable de tiempo en comparación con los métodos de cultivo convencionales, donde habría que analizar entre 500 y 1.000 plantas para este fin."

Por lo tanto, el método CRISPR/Cas optimizado es una herramienta prometedora para la inserción selectiva de genes en plantas superiores y posiblemente también en otros organismos. En el futuro, los fitomejoradores podrían utilizar este método, por ejemplo, para reintroducir genes de resistencia perdidos contra patógenos de especies silvestres o variedades cultivadas antiguas en variedades élite modernas y de alto rendimiento. De esa manera, rasgos deseables como estos podrían mejorar el fitomejoramiento y contribuir al desarrollo de variedades de cultivos más robustas.

Para la ciencia, este enfoque ofrece grandes oportunidades para reemplazar elegantemente ciertos genes vegetales con copias modificadas de sí mismos en un solo paso. Esto es particularmente útil para dilucidar la función genética.