Un equipo de investigadores interdisciplinarios dirigido por Penn State ha desarrollado técnicas para mejorar la eficiencia de CRISPR-Cas9, la técnica de edición del genoma que ganó el Premio Nobel en 2020. Si bien CRISPR-Cas9 es más rápida, menos costosa y más precisa que otras técnicas de edición de genes métodos, según el líder del proyecto Xiaojun "Lance" Lian, profesor asociado de ingeniería biomédica y biología en Penn State, la tecnología tiene limitaciones, especialmente en aplicaciones para mejorar la salud humana.

Los investigadores desarrollaron un proceso más eficiente y accesible para aplicar los sistemas CRISPR-Cas9 en células madre pluripotentes humanas (hPSC), derivadas de líneas de células madre aprobadas por el gobierno federal, que según Lian podrían hacer avanzar en gran medida el diagnóstico y el tratamiento de los trastornos genéticos. El enfoque se publicó el 7 de septiembre en Cell Reports Methods .

CRISPR-Cas9, que significa repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas y proteína 9 asociada a CRISPR, brinda a los científicos la capacidad de identificar ubicaciones precisas del código genético para cambiar el ADN, brindando oportunidades para crear nuevas herramientas de diagnóstico y potencialmente corregir mutaciones para tratar causas genéticas. de enfermedad

"El genoma humano es enorme, y CRISPR-Cas9 hace posible que los científicos encuentren y apunten a un gen mutado con el fin de estudiarlo", dijo Lian.

CRISPR utiliza un disco de material genético, conocido como ADN plasmídico, para administrar ácido ribonucleico (ARN) guiado que posiciona la enzima Cas9 en la ubicación precisa del gen objetivo. Cuando se localiza el ADN, Cas9 se une a él y lo corta, permitiendo que otro ADN repare el corte. Luego, los investigadores pueden ver cómo la eliminación cambia la expresión del gen. Pero existen problemas de eficiencia de entrega y edición con los métodos CRISPR basados ​​en ADN actuales, según Lian.

"La entrega de efectores CRISPR de ADN es baja", dijo. "Solo entre el 20 % y el 30 % de las células objetivo recibirán ADN de edición de genes cuando se usa CRISPR. La entrega de ARN en las células puede ser más eficiente; sin embargo, cuando se introduce el ARN regular, las células pueden verlo como un virus. Destruyen el ARN antes de que pueda producir proteínas, digamos, en cuestión de unas pocas horas, y, al hacerlo, destruir el intento de edición de genes".

Para mejorar el resultado, los investigadores cambiaron la forma en que las herramientas de edición del genoma se entregan a las células madre, utilizando ARN modificado (modRNA). El modRNA se diferencia del ADN plasmídico en que reemplaza uno de los sustratos básicos que se encuentran en el ARN con una versión modificada químicamente y se estabiliza con un soporte estructural más fuerte.

"Se descubrió que el ARN mod es notablemente más eficiente que el ADN plasmídico", dijo Lian. "Alrededor del 90 % de las células recibieron el modRNA de una simple transfección, por lo que pudo permanecer en su lugar y hacer su trabajo".

Los investigadores también encontraron que la cantidad de tiempo que el modRNA estuvo en su lugar era ideal:lo suficiente como para modificar las células, pero no tanto como para causar actividad fuera del objetivo. Pero modRNA introdujo otro problema, según Lian.

Cuando modRNA Cas9 se entrega con éxito al gen objetivo, crea una ruptura de doble cadena en el genoma, que algunas células intentarán reparar. Los que se arreglan solos pueden pasar la reparación, o "mutación", a su descendencia. Este es el proceso que los investigadores quieren entender mejor, así que estas son las células que quieren recolectar y estudiar. El problema, dijo Lian, es que la mayoría de las células con esta ruptura lo identifican como un problema importante con el genoma y se autodestruirán en lugar de intentar repararse.

Para reducir los efectos secundarios tóxicos de Cas9 y ayudar a las células editadas a sobrevivir, el equipo de Lian introdujo una pequeña proteína conocida por ayudar a las células a crecer. Según Lian, esta proteína añadida inhibió la muerte celular y mejoró la eficiencia de edición de Cas9 hasta en un 84 %.

Los investigadores también descubrieron que el modRNA podría mejorar otras técnicas de edición de genes, como la edición de bases. La edición de bases puede anular genes o corregir mutaciones en el genoma mediante el uso de una proteína para cambiar un solo nucleótido en lugar de cortar ambas hebras, como hace CRISPR.

"Transfectamos células madre con una proteína de edición de base basada en plásmido o modRNA", dijo Lian. "Nuestro método basado en modRNA fue más de cuatro veces más eficiente, con un 68 %, que la técnica basada en plásmidos, con un 16 % aproximadamente, en la edición exitosa del genoma".

Según Lian, a medida que más laboratorios de edición de genes mejoren la eficiencia y la eficacia de la edición de genes, los investigadores podrán comprender mejor los genes y sus funciones más rápidamente.

"El cuerpo humano tiene más de 20.000 genes, pero estudiamos las funciones de solo alrededor del 10% de ellos", dijo Lian. "Examinar el propósito de cada gen restante, uno a la vez, podría llevar toda una vida. El uso de células madre diseñadas a partir de nuestras técnicas de edición de genes altamente eficientes puede acelerar en gran medida este proceso". + Explora más

Estudiar enfermedades con una mejor entrega de herramientas de edición de genes