Antes de que puedan secuenciar el ADN o alterarlo mediante la ingeniería genética, los científicos primero deben aislarlo. Esto puede parecer una tarea difícil, ya que las células contienen una amplia variedad de otros compuestos como proteínas, grasas, azúcares y moléculas pequeñas. Afortunadamente, los biólogos pueden hacer uso de las propiedades químicas del ADN para separar el ADN de estos contaminantes y prepararlo para un estudio posterior. Este proceso se llama extracción de ADN.
Cell Lysis
Existen muchas técnicas diferentes para la extracción de ADN. El utilizado por un laboratorio individual depende del tipo de experimento que se realizará y cuán puro debe ser el ADN. Los científicos generalmente comienzan con una muestra que contiene células (un tejido o una muestra de sangre, por ejemplo) y rompen las células abiertas o las lisan. Hay una variedad de formas en que puedes lisar las células. Agregar un detergente hará que se separen, ya que los someterá a ondas de sonido de alta frecuencia. Alternativamente, mezclar la muestra con perlas de vidrio y hacerla vibrar rápidamente romperá físicamente las células y liberará sus contenidos.
Enfoques rápidos y sucios
Si no se requiere alta pureza, los científicos pueden agregar un enzima llamada proteinasa K para descomponer la mayoría de las proteínas en la muestra y luego usarla tal como está. Sin embargo, esta técnica es muy sucia, ya que la mayoría de los contaminantes aún están presentes, por lo que solo es adecuada si la velocidad es una prioridad y la pureza no es un problema. Otro enfoque rápido y sucio consiste en eliminar las proteínas aumentando la concentración de sal mediante la adición de sales como el acetato de amonio o de potasio para forzar a las proteínas a precipitar. Esta técnica también está bastante sucia ya que muchos otros contaminantes todavía están presentes.
Extracción de fenol-cloroformo
Otro enfoque es lisar las células con detergente y luego mezclar la solución con alcohol isoamílico, cloroformo y fenol . La solución luego se separa en dos capas. Las proteínas terminan en la capa orgánica superior, mientras que el ADN permanece en la capa acuosa inferior. Esta técnica requiere un control cuidadoso de la concentración de sal y el pH para obtener buenos resultados. Es lento, y tanto el fenol como el cloroformo son productos químicos altamente tóxicos. En consecuencia, mientras que las extracciones de fenol-cloroformo fueron una vez rutinarias, otras técnicas se han vuelto más populares en los últimos años.
Cromatografía de intercambio aniónico
La cromatografía de intercambio aniónico ofrece mayor pureza y resultados más consistentes que el fenol -extracción de cloroformo. Un tubo o columna está lleno de pequeñas partículas que tienen sitios cargados positivamente donde se puede unir una molécula o un anión con carga negativa. El ADN se une a estos sitios de intercambio aniónico mientras que otros contaminantes como las proteínas y el ARN se eliminan de la columna. Más tarde, se usa una solución rica en sal para extraer el ADN de la columna.
Kits
La técnica más rápida y quizás más confiable para purificar el ADN es el uso de un kit especialmente fabricado. Estos kits contienen membranas de gel de sílice en un tubo. El ADN se adhiere a la membrana mientras que otros contaminantes se eliminan mediante una serie de soluciones salinas especialmente preparadas que vienen con el kit. Finalmente, el ADN se lava de la columna con una solución baja en sal. Estos kits son rápidos, fáciles de usar y ofrecen resultados reproducibles.
Absorbancia
Una vez que el ADN ha sido aislado y resuspendido en una solución tampón controlada por pH, el último paso es probar su pureza . Una forma fácil y conveniente de hacerlo es comprobando cuánta luz ultravioleta absorbe en las longitudes de onda de 260 y 280 nanómetros. La absorción a 260 nanómetros dividida por absorción a 280 nanómetros debería ser igual a 1,8 si el ADN es puro. La medición de la absorbancia a 260 nanómetros también le permite determinar la concentración del ADN.
