La mineralización está mediada por osteoblastos, que segregan precursores minerales a través de vesículas de matriz (MV) como proceso fundamental en los vertebrados. Las vesículas son ricas en calcio y fosfato, que contiene materiales orgánicos como proteínas ácidas. En un nuevo estudio ahora publicado en Avances de la ciencia , Tomoaki Iwayama y colegas de los departamentos de periodoncia, investigación biomédica, ciencia oral, El desarrollo de biomateriales y anatomía oral utilizó microscopía dieléctrica asistida por electrones de barrido (SE-ADM) y microscopía de superresolución (SRM) para evaluar los osteoblastos vivos durante las condiciones de mineralización a una resolución de nano nivel. Descubrieron que las vesículas que contienen calcio son cuerpos multivelesiculares que contienen nanovesículas mineralizantes o vesículas de matriz (MV). Según las observaciones, las MV podrían transportarse junto con los lisosomas y secretarse por exocitosis. Iwayama y col. presentó pruebas de que los lisosomas podían transportar fosfato de calcio amorfo en las células de osteoblastos mineralizantes.

Durante el proceso fisiológico de mineralización ósea, el depósito de cristales de fosfato cálcico se produce en la matriz extracelular como un proceso fundamental en todos los vertebrados. En 1967, los biólogos Clarke Anderson y Ermanno Bonucci, partículas relacionadas con minerales visualizadas individualmente en el espacio extracelular mediante microscopía electrónica (EM). Posteriormente, los científicos reconocieron estas partículas como nano-vesículas mineralizantes o vesículas de matriz (MV). Durante los últimos 50 años de estudios EM sobre VM, Los biólogos se han esforzado por comprender el mecanismo de formación y secreción de VM, que sigue siendo en gran parte desconocido.

Aclarar el proceso de mineralización de células vivas con EM es un desafío ya que la preparación de muestras para EM requiere pasos tanto en la fijación química como en la deshidratación alcohólica. Los pasos pueden inducir artefactos e incluso disolver o eliminar precursores minerales inestables dejando un andamio orgánico conocido como "fantasma de cristal". Si bien los científicos habían utilizado con éxito el proceso de EM utilizando tejido fijo y deshidratado para ver la estructura de las fibrillas de colágeno mineralizado en el hueso, estudiar precursores minerales, deben emplear procesos crio-EM para evitar la deshidratación y facilitar costosos, Enfriamiento extremadamente rápido con muestras pequeñas.

Para superar estas limitaciones en el presente trabajo, Iwayama y col. utilizó un nuevo sistema microscópico conocido como microscopía dieléctrica asistida por electrones de barrido (SE-ADM). El método había logrado previamente una resolución a nanoescala e imágenes de alto contraste para células de mamíferos en medios acuosos sin tinción. Los científicos utilizaron la misma técnica (SE-ADM de alta resolución) para explorar la posibilidad de ver MV en osteoblastos intactos para comprender la biogénesis del tráfico de MV. Para la línea celular de osteoblastos utilizaron la línea celular osteoblástica murina (ratón) KUSA-A1, con alta capacidad osteogénica in vitro e in vivo. Después del cultivo celular en condiciones adecuadas, Iwayama y col. observó las células con SE-ADM para identificar estructuras intracelulares normales. Los científicos observaron que las MV se alineaban con las fibrillas de colágeno después de 4 a 10 días de crecimiento celular en medios osteogénicos y que el tamaño de las partículas secretadas aumentaba debido a la fusión o al crecimiento de las partículas. con sus tamaños consistentes con informes anteriores para sugerir que efectivamente eran MV.

Tras un examen más detenido con SE-ADM, observaron la participación de la vía lisosomal para transportar y secretar VM intraluminales en un proceso similar a los exosomas. Curiosamente, tanto los exosomas como los MV se clasifican como vesículas extracelulares con tamaños similares; ambos son secretados por osteoblastos y tienen funciones compartidas durante la comunicación célula-célula.

En el siguiente paso, Iwayama y col. examinó si estas partículas eran MV que contenían calcio y / o fosfato. Para esto, cultivaron las células en medio osteogénico durante 7 días y las observaron usando SE-ADM para registrar estructuras muy lisas sin facetas cristalinas. Esto sugirió que las VM no cristalizaron sino que permanecieron amorfas como también se registró en un estudio anterior. Cuando los científicos examinaron las MV en una película de SiN (mononitruro de silicio), observaron picos agudos correspondientes al fósforo, calcio, elementos de carbono y oxígeno. Confirmaron los hallazgos utilizando espectroscopía Raman para mostrar la presencia de fosfato de calcio dentro de las VM.

Los científicos también investigaron los efectos de la hipofosfatasia, una condición médica codificada por el Gen Alpl (fosfatasa alcalina) , en donde los osteoblastos no experimentan mineralización in vitro. Para esto, editaron el genoma de las células de osteoblastos utilizando la tecnología de edición del genoma CRISPR-Cas9 para generar clones de osteoblastos knockout de Alpl. Cuando Iwayama et al. examinó los clones knockout utilizando SE-ADM de alta resolución, no observaron MV, que se confirmó además mediante análisis espectrométrico debido a la ausencia de picos de fósforo y calcio.

Después de observar directamente la producción y secreción de MV utilizando SE-ADM, los científicos investigaron más a fondo la participación de los lisosomas en el tráfico intracelular de MV para observar la mineralización de osteoblastos vivos. Cultivaron las células en un medio osteogénico que contenía calcio y las tiñeron con LysoTracker para detectar los componentes intracelulares de interés. Iwayama y col. localizó las vesículas llenas de calceína emparejadas con lisosomas para sugerir la biogénesis de MV dentro de los lisosomas después de su fusión con calceína ⁺ vesículas. Los científicos siguieron los experimentos con la pérdida de función y los estudios de inhibición funcional para deconstruir aún más las vías y examinar los mecanismos de acción intracelulares durante la mineralización de células vivas in vitro.

Scientists had previously reported the involvement of mitochondria during mineralization due to the presence of electron-dense calcium and phosphorous-rich granules in osteoblast mitochondria. This was observed with a modified cryotechnique. Es más, reports also suggest the direct contact of lysosomes and mitochondria with functional significance. When Iwayama et al. stained cells with LysoTracker together with MitoTracker and observed the intracellular components under N-SIM structured illumination super-resolution microscopy (SRM). They observed the presence of most calcein-fulfilled vesicles next to mitochondria and matched with lysosomes. During SRM-time lapse imaging, the scientists further obtained views of intracellular transport of LysoTracker containing vesicles fused to static calcein vacuoles adjacent to mitochondria to validate their hypothesis.

De este modo, together with observations of other SRM systems and additional cell lines, Tomoaki Iwayama and colleagues proposed a mineralization mechanism. Wherein lysosomes played a central role in intracellular MV biogenesis and trafficking within osteoblasts. It was reasonable to involve lysosomes for osteoblasts to transport amorphous calcium phosphate without crystallization during its transport in the cytosol. The scientists aim to conduct further experiments to understand the regulatory molecules for MVs and investigate if MVs and exosomes have similar constitutions and mechanism underlying their generation, secretion and function. The SE-ADM strategy used in the present work can be installed into existing scanning electron microscopy apparatus at a low cost. The work developed in the study will offer non-invasive, high-resolution imaging at the nanoscale applicable to all scientific fields.

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