Investigadores de la Escuela de Ingeniería McKelvey de la Universidad de Washington en St. Louis han sido pioneros en una nueva técnica que permitirá obtener imágenes de mayor resolución de objetos muy pequeños como las neuronas. La técnica, que mejora un método existente llamado microscopía de expansión, se describe en un nuevo artículo publicado en la revista Nano Letters. .

La mayoría de las personas están familiarizadas con los microscopios que utilizan lentes para hacer que un objeto parezca más grande y más fácil de ver para el ojo humano. Pero la microscopía de expansión (ExM) funciona prácticamente de manera opuesta:agrandando el objeto en sí. Los científicos recubren la muestra (una célula, por ejemplo) con pequeños marcadores emisores de luz llamados fluoróforos y luego incrustan la muestra dentro de un gel que se expande cuando entra en contacto con el agua. A medida que la muestra crece, las etiquetas fluorescentes trazan los contornos de características demasiado pequeñas para verlas, como las ramas delgadas, o dendritas, que crecen a partir de las células cerebrales.

Pero la microscopía de expansión tiene un gran inconveniente. La señal luminosa emitida por los fluoróforos convencionales pierde gran parte de su intensidad (más del 50%) durante los pasos de preparación y expansión.

"Cuando haces las cosas más grandes, no es necesariamente bueno, porque si no cambias la cantidad de señal que ya está presente, esa señal se debilita", afirmó Barani Raman, profesor de ingeniería biomédica.

Raman y Srikanth Singamaneni, profesor de Lilyan &E. Lisle Hughes en el Departamento de Ingeniería Mecánica y Ciencia de Materiales, han abordado este problema utilizando marcadores fluorescentes ultrabrillantes llamados fluores plasmónicos (PF). Singamaneni desarrolló los PF para otras aplicaciones en 2020.

"Es un buen ejemplo de dos personas con experiencia completamente diferente que tienen una conversación casual y dicen:'Está bien, este problema está aquí en un campo, pero la solución está en otro campo'", dijo Raman. El equipo ha denominado su nueva técnica "microscopía de expansión mejorada con plasmón" o p-ExM.

El flúor plasmónico se construye a partir de una partícula central de oro envuelta en una capa de plata, que luego se cubre con una capa de otros materiales, incluidos fluoróforos convencionales. La estructura está diseñada para proteger los fluoróforos de los químicos agresivos utilizados en el proceso y para hacer que la señal luminosa de los fluoróforos sea mucho más brillante. La técnica ayudará a los investigadores a mapear redes neuronales o las conexiones entre neuronas.

"La nanopartícula metálica sirve como antena, lo que significa que puede atraer más luz hacia los fluoróforos", dijo Singamaneni. La interacción entre la nanopartícula de oro y plata y los fluoróforos también hace que los fluoróforos emitan más fotones de los que normalmente emitirían. Como resultado, el fluor plasmónico es casi cuatro órdenes de magnitud más brillante de lo que serían los marcadores fluorescentes por sí solos. Los fluores plasmónicos también resuelven el problema de la dilución de la señal porque los marcadores fluorescentes están adheridos directamente a la nanopartícula, por lo que no se separan cuando la muestra se expande.

Para demostrar el potencial de la microscopía de expansión mejorada con plasmones, los investigadores la utilizaron para estudiar una muestra de neuronas de la región del hipocampo del cerebro. En algunos casos, las ramas en ciernes de la neurona, llamadas neuritas, están demasiado cerca unas de otras para distinguirlas sin la ayuda de técnicas como la microscopía de expansión.

"Cuando dos neuritas están demasiado cerca una de la otra, no podemos resolverlas. El software piensa que son sólo una neurita", dijo Singamaneni.

Después de etiquetar las células con fluores plasmónicos ultrabrillantes y expandir la muestra, el equipo pudo contar el número de neuritas, cuantificar el área total de las neuritas y medir la longitud de las neuritas individuales. Identificaron 2,5 veces más puntos terminales de neuritas de los que eran visibles antes de ampliar la muestra.

Cuando el equipo comparó el rendimiento del fluoróforo plasmónico con el de los fluoróforos por sí solos, descubrieron que el fluoróforo plasmónico retenía aproximadamente el 76% de la señal luminosa, mientras que los fluoróforos retenían menos del 16%. Los resultados del equipo también mostraron que la microscopía de expansión mejorada con plasmones es compatible con los protocolos de microscopía de expansión existentes, lo que significa que se pueden utilizar fluores plasmónicos en lugar de fluoróforos convencionales en estudios futuros. También se pueden crear PF a partir de cualquier fluoróforo que se adapte a las necesidades de los investigadores.

Más información: Priya Rathi et al, Microscopía de expansión mejorada por plasmón, Nano Letters (2023). DOI:10.1021/acs.nanolett.3c01256

Información de la revista: Nanoletras

Proporcionado por la Universidad de Washington en St. Louis